Dr. Ιάκωβος Θεοδοσίου MD. DipU

Ιατρός Διαιτολόγος

καρκίνος & διατροφή

διαιτολογική μεταβολική προσέγγιση
στην θεραπεία του καρκίνου

Menu

καρκίνος – κυτταρικός κύκλος – checkpoint

Τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου είναι μηχανισμοί ελέγχου των ευκαρυωτικών κυττάρων, που εξασφαλίζουν την σωστή διαίρεση του κυττάρου.

Κάθε σημείο ελέγχου χρησιμεύει ως ένα ισχυρό σημείο, κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, που αξιολογούνται οι συνθήκες, η ικανότητα και η ακεραιότητα και η επάρκεια των υλικών του κυττάρου.

Ο έλεγχος αυτός επιτρέπει κάθε φορά την πρόοδο ή την διακοπή των διαφόρων φάσεων εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου.

Επί του παρόντος, υπάρχουν τρία γνωστά σημεία ελέγχου: το σημείο ελέγχου G1, το οποίο είναι επίσης γνωστό ως το σημείο ελέγχου περιορισμού ή έναρξης ή (Major Checkpoint), το σημείο ελέγχου G2/M και το σημείο ελέγχου μεταφάσεων, γνωστό και ως σημείο ελέγχου του άξονα (spindle checkpoint).

Έλεγχος του κυτταρικού κύκλου

Η διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι πολύ μεταβλητή, ακόμη και εντός των κυττάρων ενός μόνο οργανισμού.

Στους ανθρώπους, η συχνότητα αναγέννησης των κυττάρων κυμαίνεται.
Από λίγες ώρες στην πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη, σε ένα μέσο όρο των δύο έως πέντε ημέρες για τα επιθηλιακά κύτταρα, έως και μια ολόκληρη ανθρώπινη ζωή για τα κύτταρα των νευρώνων και του καρδιακού μυ, όπου ένα κύτταρο μπορεί να βρίσκεται στην φάση G0.

Υπάρχουν επίσης διαφοροποιήσεις στο χρόνο που ένα κύτταρο ξοδεύει σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Όταν τα κύτταρα των θηλαστικών που διαχωρίζονται γρήγορα αναπτύσσονται σε καλλιέργεια (εκτός του σώματος υπό βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης), το μήκος του κύκλου είναι περίπου 24 ώρες. Σε ταχέως διαιρούμενα ανθρώπινα κύτταρα με 24-ωρω κυτταρικό κύκλο, η G1 φάση διαρκεί περίπου εννέα ώρες, η φάση S διαρκεί 10 ώρες, η φάση G2 διαρκεί περίπου τέσσερις και μισή ώρες, και η φάση Μ διαρκεί περίπου μισή ώρα . Στα πρώιμα έμβρυα μυγών φρούτων, ο κυτταρικός κύκλος ολοκληρώνεται σε περίπου οκτώ λεπτά. Ο χρονισμός των συμβάντων στον κυτταρικό κύκλο ελέγχεται από μηχανισμούς που είναι τόσο εσωτερικοί όσο και εξωτερικοί του κυττάρου.

Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου από εξωτερικά συμβάντα

Τόσο η έναρξη όσο και η αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης προκαλούνται από εξωτερικά γεγονότα του κυττάρου όταν πρόκειται να αρχίσει η διαδικασία αντιγραφής.
Ένα τέτοιο συμβάν, μπορεί να είναι τόσο απλό, όσο ο θάνατος ενός γειτονικού κυττάρου ή η απελευθέρωση ορμονών που προάγουν την ανάπτυξη, όπως η ανθρώπινη αυξητική ορμόνη (HGH).
Η έλλειψη HGH μπορεί να εμποδίσει την κυτταρική διαίρεση, με αποτέλεσμα νανισμό, ενώ υπερβολική HGH μπορεί να οδηγήσει σε γιγαντισμό.
Η συσσώρευση κυττάρων μπορεί επίσης να αναστείλει την κυτταρική διαίρεση. Ένας άλλος παράγοντας που μπορεί να προκαλέσει κυτταρική διαίρεση είναι το μέγεθος του κυττάρου. καθώς αυξάνεται ένα κύτταρο, γίνεται αναποτελεσματική λόγω της μείωσης της αναλογίας επιφάνειας προς όγκο.
Όποια και αν είναι η πηγή του μηνύματος, το κύτταρο λαμβάνει το σήμα και μια σειρά γεγονότων στο κύτταρο, επιτρέπει να προχωρήσει σε ενδιάμεση φάση(interphase). Προχωρώντας προς τα εμπρός από αυτό το σημείο έναρξης, πρέπει να τηρούνται όλες οι παράμετροι που απαιτούνται κατά τη διάρκεια κάθε φάσης κυκλικού κύκλου, διαφορετικά ο κύκλος δεν μπορεί να προχωρήσει.

G1 - CHECKPOINT (περιορισμός)

Το σημείο ελέγχου G1, επίσης γνωστό ως σημείο περιορισμού στα κύτταρα θηλαστικών, είναι το σημείο στο οποίο το κύτταρο δεσμεύεται να εισέλθει στον κυτταρικό κύκλο. Καθώς το κύτταρο εξελίσσεται μέσω της G1, ανάλογα με τις εσωτερικές και εξωτερικές συνθήκες, μπορεί είτε να καθυστερήσει το G1, να εισέλθει σε κατάσταση ηρεμίας γνωστή ως G0 ή να προχωρήσει πέρα από το σημείο περιορισμού (checkpoint).
Η βλάβη του DNA είναι η κύρια ένδειξη για να περιοριστεί ένα κύτταρο και να μην εισέλθει στον κυτταρικό κύκλο. Η απόφαση να δεσμευθεί σε ένα νέο κύκλο διαίρεσης κυττάρων συμβαίνει όταν το κύτταρο ενεργοποιεί την κατάλληλη Cylin-Cdk η οποία προάγει την είσοδο στη φάση S.

Η οικογένεια γονιδίων E2F είναι μια ομάδα παραγόντων μεταγραφής που στοχεύουν πολλά γονίδια που είναι σημαντικά για τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων των Cyclins, CDKs, ρυθμιστών σημείων ελέγχου(checkpoint regulators) και πρωτεϊνών επισκευής DNA.
Η λανθασμένη ρύθμιση της οικογένειας E2F βρίσκεται συχνά σε περιπτώσεις καρκίνου, παρέχοντας στοιχεία ότι η οικογένεια E2F είναι απαραίτητη για τη σφιχτή ρύθμιση της αντιγραφής και της διαίρεσης του DNA.

Cellular proliferation involves the inactivation of at least one member of the retinoblastoma family thereby leading to differential binding properties and phosphorylation specific Rb markers characterizing the G1/S transition.

The general mechanism by which the Rb family exerts its effects is through regulatory binding of the E2F family, inhibiting E2F-mediated transcription of cell cycle-dependent genes such as A and E type Cyclins.

Phosphorylated pRb/p105 is present at relatively constant levels throughout the cell cycle; however, at the G1/S transition point it is sequentially phosphorylated by Cyclin D:Cdk 4/6 and Cyclin E:Cdk 2 complexes, respectively, leading to a release of E2F and allowing cell cycle progression.

Κατά τη διάρκεια της πρώιμης G1, υπάρχουν τρεις μεταγραφικοί καταστολείς, που δεσμεύουν τους παράγοντες μεταγραφής E2F. Οι τρεις πρωτεΐνες μεταγραφικοί αναστολείς είναι: η πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (Rb), p107 και p130, οι οποίες δεσμεύονται με τους παράγοντες μεταγραφής Ε2F για να αποτρέψουν την εξέλιξη πέρα από το σημείο ελέγχου G1.

Η οικογένεια γονιδίων E2F περιέχει μερικές πρωτεΐνες με μηχανισμούς ενεργοποίησης και μερικές πρωτεΐνες με μηχανισμούς καταστολής. Τα p107 και p130 δρουν ως συν-καταστολείς για τα E2F4 και E2F5, τα οποία δρουν για την καταστολή της μεταγραφής των παραγόντων προαγωγής G1 προς S. Η τρίτη πρωτεΐνη, pRb, δεσμεύεται και καταστέλλει τα E2F1, E2F2 και E2F3, τα οποία είναι οι πρωτεΐνες E2F με ενεργοποιητικές ικανότητες.

Η θετική ανατροφοδότηση παίζει ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση της εξέλιξης από τη φάση G1 σε S, ιδιαίτερα η φωσφορυλίωση της pRb από ένα σύμπλοκο Cyclin/Cdk πρωτεΐνης.  Η μη φωσφορυλιωμένη Rb, ρυθμίζει την έξοδο και διαφοροποίηση του κυτταρικού κύκλου GO.

Κατά την έναρξη της φάσης G1, αυξητικοί παράγοντες και σήμα καταστροφής DNA παίζουν ρόλο για την αύξηση των επιπέδων CyclinD, τα οποία στη συνέχεια δεσμεύονται με Cdk4 και Cdk6 για να σχηματίσουν τα σύμπλοκα CyclinD/Cdk4,6. Αυτό το σύμπλεγμα είναι γνωστό ότι απενεργοποιεί την Rb με φωσφορυλίωση.

Οι μεταγραφικοί παράγοντες E2F4 και E2F5 εξαρτώνται από το p107 και το p130 για να διατηρήσουν τον πυρηνικό εντοπισμό τους. Εντούτοις, οι CyclinD/Cdk4,6 φωσφορυλιώνουν επίσης τις p107 και p130, μια διαδικασία η οποία απελευθερώνει την πρόσδεση τους από τα Ε2F4 και 5 (τα οποία στη συνέχεια διαφεύγουν στο κυτταρόπλασμα) επιτρέποντας στο Ε2F1 και 3 να δεσμεύεται στο DNA και να εκκινεί τη μεταγραφή της CyclineΕ που δεσμεύεται με την Cdk2.

CyclineΕ/Cdk2 διαδραματίζει έναν επιπλέον σημαντικό ρόλο φωσφορυλίωσης στην μετάβαση G1 προς S. Ιδιαίτερα, η CyclinE/Cdk2 προωθεί ένα βρόχο θετικής ανάδρασης που δημιουργεί έναν “όλα ή τίποτα” διακότη και εξασφαλίζει ότι τα κύτταρα δεν γλιστρούν εμπρός και πίσω μεταξύ των φάσεων του κυτταρικού κύκλου.
Η CyclinE/Cdk2 προχωρά στη φωσφορυλίωση της pRb σε όλες τις θέσεις φωσφορυλίωσης της, που ονομάζεται επίσης “υπερφωσφορυλιωμένη” και απενεργοποιεί την pRb.
Η υπερφωσφορυλίωση του pRb θεωρείται το σημείο περιορισμού της όψιμης G1, μετά την οποία το κύτταρο δεν μπορεί να πάει προς τα πίσω στον κυτταρικό κύκλο. Σε αυτό το σημείο, οι πρωτεΐνες E2F1 και 3 συνδέονται με το DNA και μεταγράφουν την CyclinΑ και την Cdk6.

Ο εξαρτώμενος από την κυκλίνη αναστολέας κινάσης 1Β (CDKN1B), επίσης γνωστός ως p27, δεσμεύεται και παρεμποδίζει την ενεργοποίηση της CyclinE/Cdk2 με αναστολή. Ωστόσο, καθώς η Cyclin-Α συσσωρεύεται και συνδέεται με το Cdk2, σχηματίζουν και συγκαλύπτουν και αναστέλλουν την p27. Η εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση σε φάση G1 συνεργάζεται με την εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση  της φάσης S με στόχο αποικοδόμηση της p27. Με τη σειρά του, αυτό επιτρέπει την πλήρη ενεργοποίηση της CyclinΑ/Cdk2, ενός συμπλόκου το οποίο φωσφορυλιώνει το E2F1 και 3 ξεκινώντας την αποσύνδεσή τους από τις θέσεις υποκινητή DΝΑ. Αυτό επιτρέπει στο E2F6-8 να δεσμεύεται στο DNA και να εμποδίζει τη μεταγραφή.

Ο αρνητικός βρόγχος ανάδρασης που χρησιμοποιείται για την επιτυχή αναστολή του αναστολέα, p27, είναι μια άλλη βασική διαδικασία που χρησιμοποιείται από τα κύτταρα για να εξασφαλιστεί μονοκατευθυντική κίνηση και καμία αναστροφή του κυκλικού κύκλου.

G2-M CHECKPOINT (σημείο ελέγχου ζημιών DNA)

Μετά την αντιγραφή του DNA στη φάση S, το κύτταρο υφίσταται μια φάση ανάπτυξης γνωστή ως G2. Κατά τη διάρκεια αυτού του χρόνου, παράγονται οι απαραίτητες μιτωτικές πρωτεΐνες και το κύτταρο υποβάλλεται και πάλι σε ρυθμιστικούς μηχανισμούς για να εξασφαλιστεί η κατάλληλη κατάσταση για την είσοδο στην πολλαπλασιαστική Μιτωτική (Μ) φάση. Πολλά μηχανικά σημεία ελέγχου εμπλέκονται σε αυτή τη μετάβαση από G2 σε M, με έναν κοινό ενωτικό παράγοντα της δραστηριότητας Cyclin/Cdk.

Αν και υπάρχουν παραλλαγές στα απαιτούμενα σύμπλοκα Cyclin-Cdk σε διάφορους οργανισμούς, η αναγκαιότητα της δραστηριότητας κινάσης διατηρείται και συνήθως επικεντρώνεται σε ένα μόνο ζεύγος.

Παρόμοια όπως και στην φάση S, στην G2 υπάρχει ένα σημείο ελέγχου βλαβών του DNA. Το κύτταρο εξετάζεται και πάλι το DNA για περιοχές βλάβης ή ελλιπούς αναδιπλασιασμού και οι κινάσες ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3 related) και ATM (Ataxia telangiectasia mutated) δεσμεύονται στις θέσεις βλάβης.
Ενεργοποιείται επίσης η ενεργοποίηση των Chk1 και Chk2, καθώς και η ενεργοποίηση του p53, για την πρόκληση διακοπής του κυτταρικού κύκλου και διακοπής της εξέλιξης στη μίτωση. Ένα πρόσθετο συστατικό της φάσης S, το προ-αντιγραφικό σύμπλεγμα, πρέπει να απενεργοποιηθεί μέσω φωσφορυλίωσης της CyclinΒ/Cdk1.

Καθώς αξιολογούνται αυτά τα προηγούμενα σημεία ελέγχου, η συσσώρευση πρωτεϊνών G2 χρησιμεύει στην ενεργοποίηση της δραστηριότητας της cyclinB/Cdk1 μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Η CyclinA/Cdk2 ενεργοποιεί την Cdc25, έναν ενεργοποιητή της CyclinΒ/Cdk1, ο οποίος στη συνέχεια απενεργοποιεί τον αναστολέα της CyclinΒ/Cdk1, Wee1. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα ένα βρόχο θετικής ανάδρασης, αυξάνοντας σημαντικά την έκφραση της CyclinB και την ενεργοποίηση της Cdk1.

When Cdc2 became CDK1

Το Cdc2 βρίσκεται στην καρδιά του κύκλου των ευκαρυωτικών κυττάρων.
Τώρα γνωρίζουμε ότι ενεργοποιείται μόνο όταν συνδέεται με έναν συνεργάτη κυκλίνης και πράγματι είναι το καθοριστικό μέλος μιας οικογένειας εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάσες (CDKs).
Πριν από δεκαπέντε χρόνια τα πράγματα δεν ήταν τόσο ξεκάθαρα. Η σημασία του Cdc2 ως διατηρημένου γονιδίου ελέγχου κυτταρικού κύκλου ήταν προφανής.
Ωστόσο, η σύνδεση μεταξύ Cdc2, των περιοδικά αποικοδομημένων κυκλικών και του παράγοντα που προκάλεσε την ωρίμανσης (MPF) περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1971.
Ο καθαρισμός του MPF από διάφορες ομάδες αποκάλυψε ότι περιέχει Cdc2, και το ότι η Cdc2 στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι συν-καθιζάνει με κυκλίνες. Δεν υπήρχε τότε προηγούμενο για μια κινάση που απαιτούσε μια βοηθητική υπομονάδα. η κυκλίνη αντιθέτως πιστεύεται ότι αποσυνδέει μια ανασταλτική υπομονάδα από την κινάση. Μελέτες στις οποίες η κινάση ειδικής φάσης Μ καθαρίστηκε μέχρι ομοιογένειας, αποκάλυψαν ότι το δραστικό ένζυμο είναι ένα ετεροδιμερές Cdc2-κυκλίνης-Β το οποίο έχει δραστικότητα MPF, επαναπροσδιορίζοντας το Cdc2 ως CDK1.

When Cdc2 became CDK1
Journal of Cell Science 2002 115: e1201

Model of Cdc25 activation.
During interphase, Cdc25 is held inactive via by inhibitory phosphorylation at Ser287 and 14-3-3 binding. Likewise, PP2A/B56δ maintains Thr138 in the dephosphorylated state. At the G2/M transition, Cdc25 is activated in a stepwise fashion. First, Cdk2 phosphorylates Thr138 which triggers the release of 14-3-3. Phosphorylated keratin intermediate filaments assist in 14-3-3 removal from Cdc25 and Plk1 may also play a role in this process. Exposed Ser287 is then readily dephosphorylated by PP1[Protein phosphatase 1 (PP1) belongs to a certain class of phosphatases known as protein serine/threonine phosphatases], inducing the activation and nuclear translocation of Cdc25 and dephosphorylation of Cdc2. Once activated, Cdc2/Cyclin B phosphorylates multiple sites on Cdc25, enhancing its activity and preventing inactivation. Cdc2/Cyclin B may also activate the MAP kinase cascade which can phosphorylate Cdc25 in a parallel positive feedback loop.

Cdc25 and Wee1: Analogous opposites Jennifer A Perry,Sally Kornbluth

Checkpoint regulation of Cdc2 regulators. Prevention of Cdc2/CyclinB activation by DNA-responsive checkpoints requires the coordinate activation of Wee1 and inactivation of Cdc25 and their regulators. Solid lines represent direct regulation while dashed lines represent proposed/indirect regulation.

Cdc25 and Wee1: Analogous opposites Jennifer A Perry,Sally Kornbluth

Η Polo-like kinase-1(PLK-1) είναι μια πολύ γνωστή μιτωτική κινάση και είναι ένα ευρέως μελετημένο μέλος της οικογένειας PLK. Η παρουσία του PLK-1 αναφέρθηκε για πρώτη φορά στο Drosophila melanogaster ως μιτωτικός ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου. Από τότε, οι λειτουργίες του PLK-1 έχουν μελετηθεί εκτενώς στην μίτωση κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης. Το PLK-1 είναι πρωτεϊνική κινάση Ser/Thr που είναι πολύ συντηρημένη σε ευρύ φάσμα ευκαρυωτικών και θεωρείται πρωτο-ογκογονίδιο.

Δεδομένου ότι η υπερ-ενεργοποίηση του PLK-1 σχετίζεται ευρέως με την κακή πρόγνωση και την πρόοδο του καρκίνου, είναι μία από τις πιο διεξοδικά μελετημένες μιτωτικές κινάσες.
Κατά τη διάρκεια της μίτωσης, το PLK-1 ρυθμίζει διάφορα γεγονότα του κυτταρικού κύκλου, όπως η ωρίμανση του άξονα του άξονα, ο διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων και την κυτταροκίνηση. Ωστόσο, μελέτες έχουν δείξει ότι ο ρόλος του PLK-1 δεν περιορίζεται μόνο στη μίτωση, αλλά το PLK-1 μπορεί επίσης να ρυθμίσει άλλα ζωτικά γεγονότα πέρα από τη μίτωση, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής, της μετάφρασης, της σιλυογένεσης (ciliogenesis), της προσαρμογής και ανάκτησης του σημείου ελέγχου, της απόπτωσης, της δυναμικής των χρωμοσωμάτων κλπ. Πρόσφατες ανασκοπήσεις προσπάθησαν να ορίσουν τον ρυθμιστικό ρόλο του PLK-1 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της μιτώσεως και της ογκογένεσης, αλλά ο λειτουργικός ρόλος του πέρα από τη μίτωση εξακολουθεί να είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητος.
Η PLK-1 μπορεί να ρυθμίσει τη δραστηριότητα πολλών πρωτεϊνών που λειτουργούν εκτός της συμβατικής περιοχής. Η δυσλειτουργία αυτών των πρωτεϊνών μπορεί να προκαλέσει ασθένειες όπως η νόσος του Alzheimer, η ογκογένεση κλπ. Και μπορεί επίσης να οδηγήσει σε αντοχή στα φάρμακα.

Η PLK-1 είναι ένας από τους σημαντικότερους παίκτες στη μίτωση κατά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και η αναστολή του είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την καταπολέμηση των θανατηφόρων καρκίνων.

Ταυτόχρονα, ο λειτουργικός ρόλος του PLK-1 δεν περιορίζεται μόνο στη ρύθμιση της μίτωσης, καθώς έχει επίσης μια λειτουργική θέση πέρα ​​από τη μίτωση. Εκτός από την παραδοσιακή λειτουργία του, το PLK-1 ρυθμίζει διάφορα γεγονότα, συμπεριλαμβανομένης της αναπαραγωγής του DNA, της μεταγραφής, της μετάφρασης, της δυναμικής των χρωμοσωμάτων, της απάντησης δε βλάβη του DNA (DDR-DNA damage response), της προσαρμογής και ανάκτησης του σημείου ελέγχου, των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, της απόπτωσης, της οργανογένεσης.

Μελέτες επιβεβαίωσαν ότι το PLK-1 συμμετέχει ενεργά είτε άμεσα είτε έμμεσα σε αναδιπλασιασμό, μεταγραφή και μετάφραση DNA.
Κατά τη διάρκεια του DDR, τα κύτταρα υφίστανται μία από τις τρεις διαδικασίες. Συγκεκριμένα:
1.) Ανάκτηση σημείου ελέγχου, όταν τα κύτταρα έχουν επαρκή χρόνο για να επιδιορθώσουν την καταστροφή του DNA και να ξαναρχίσουν τον κυτταρικό κύκλο για περαιτέρω διαίρεση.
2.) Απόπτωση, εάν η βλάβη του DNA είναι ανεπανόρθωτη, ένας μηχανισμός σημείων ελέγχου ενεργοποιεί τις οδούς ελέγχου (Ataxia telangiectasia mutated)/ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3 related)οδηγώντας σε απόπτωση με τρόπο εξαρτώμενο από p53.
3.) Προσαρμογή του σημείου ελέγχου, όπου το κατεστραμμένο DNA είναι σε ανεπανόρθωτη κατάσταση και το κύτταρο υπερισχύει του μηχανισμού σημείου ελέγχου λόγω της αποτυχίας των αποπτωτικών οδών και επαναλαμβάνει την κυτταρική διαίρεση με κατεστραμμένο DNA, με αποτέλεσμα την ογκογένεση.

Η PLK-1 συμμετέχει ενεργά στις παραπάνω διαδικασίες. Κατά τη διάρκεια της μετάβασης φάσης S-G2, το Aurora-A-BORA (Aurora borealis, ένας συν-παράγοντας Aurora κινάσης Α) καταλύει την ενεργοποίηση του ενεργοποιημένου PLK-1 (PLK-1 εκκινημένου με CDK-1). Το Aurora-A ενεργοποιεί το PLK-1 με φωσφορυλίωση του KD στο Thr-210 και ενισχύει την καταλυτική δραστικότητα του PLK-1. Το φωσφορυλιωμένο KD του PLK-1 περαιτέρω φωσφορυλιώνει και ρυθμίζει τη λειτουργία των στοχευμένων πρωτεϊνών, ενώ η PBD (Polo Box Domain) του PLK-1 συμμετέχει στον υποκυτταρικό εντοπισμό ενεργοποιημένου PLK-1 για τη διευκόλυνση της μίτωσης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου.

Regulatory functional territory of PLK-1 and their substrates beyond mitosis
Shiv Kumar1, Garima Sharma, Chiranjib Chakraborty, Ashish Ranjan Sharma and Jaebong Kim1 (2017)
DOI: 10.18632/oncotarget.16290

Η ιδέα ότι τα Cdc2 και οι κυκλίνες παίζουν βασικό ρόλο στον έλεγχο της μετάπτωσης G2/M του κυτταρικού κύκλου προήλθαν σε μεγάλο βαθμό από τη γενετική ανάλυση της ζύμης ζαχαρομύκητα (Schizosaccharomyces pombe: fission yeast)  και μελετών των αχιβάδων, βατράχων, αχινοειδών και αστεροειδών και ωαρίων. Ωστόσο, χρειάστηκε πολύς χρόνος για να συνειδητοποιήσουμε ότι το Cdc2 και οι κυκλίνες σχηματίζουν ένα στοιχειομετρικό σύμπλεγμα και ότι μια υπομονάδα κυκλίνης είναι απαραίτητη για την Cdc2 υπομονάδα για να αποκτήσει τη δραστικότητα πρωτεϊνικής κινάσης.

Οι κυκλίνες αρχικά αναγνωρίστηκαν ως πρωτεΐνες των οποίων η αφθονία ταλαντεύεται κυκλικά κατά τους κυτταρικούς κύκλους και η σύνδεσή τους με τον παράγοντα προαγωγής της ωρίμανσης MPF (maturation-promoting factor), ελέγχει την είσοδο στη φάση Μ, του κυτταρικού κύκλου.

Πράγματι, χρειάστηκε πολύς χρόνος, πριν αποδειχθεί ότι η MPF είναι πρωτεϊνική κινάση και ότι είναι ένα ετεροδιμερές, που περιλαμβάνει ένα μόριο κυκλίνης και ένα μόριο Cdc2. Η γνώση αυτή αποκτήθηκε τελικά όταν το συνδεδεμένο με Cdc2 συστατικό του καθαρισμένου αστεροειδούς MPF αναλύθηκε και βρέθηκε να είναι κυκλίνη Β. Αυτή η θεμελιώδης ανακάλυψη επιβεβαιώθηκε σε σπονδυλωτά και μέλη θηλαστικών της οικογένειας Cdc2, όπου επίσης φάνηκε ότι δεσμεύονται με κυκλίνες. Ότι το Cdc2 γίνεται Cdk1, η πρώτη εξαρτώμενη από κυκλίνη πρωτεϊνική κινάση.

http://jcs.biologists.org/content/115/12/2461.long

Cell Cycle Sibling Rivalry
Cdc2 versus Cdk2

Εδώ και καιρό πιστεύαμε ότι η Cdk2 δεσμεύεται από την CyclinE ή την CyclinA και προάγει αποκλειστικά τη μετάβαση της φάσης G1/S και ότι τα σύμπλοκα Cdc2/CyclinΒ παίζουν σημαντικό ρόλο στη μίτωση. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι το Cdc2 συνδέεται με την CyclinΕ (επιπλέον της CyclinΑ και CyclinΒ) και είναι σε θέση να προάγει τη μετάβαση G1/S.
Αυτή η νέα λογική υποδηλώνει ότι τόσο το Cdk2 όσο και το Cdc2 μπορούν να κατευθύνουν τα κύτταρα μέσω της φάσης G1/S παράλληλα.
Σε αυτήν την ανασκόπηση συζητούμε το κλασικό μοντέλο κυτταρικού κύκλου και το πώς τα αποτελέσματα από τα ποντίκια knockout παρέχουν νέα στοιχεία που αντικρούουν αυτό το μοντέλο. Εστιάζουμε στους ρόλους των Cdc2 και p27 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των θηλαστικών και προτείνουμε ένα νέο μοντέλο ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου που θα φιλοξενεί αυτά τα νέα ευρήματα.

Οι Cdks προάγουν τις μεταβάσεις μεταξύ των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου.  Οι cdks των θηλαστικών συνδέονται με συγκεκριμένες κυκλίνες, πχ, οι Cdk4 ή Cdk6 συνδέονται με τις Cyclins τύπου D, η Cdk2 δεσμεύεται με την CyclinΕ και CyclinΑ και η Cdc2 δεσμεύεται με την CyclinΒ και την CyclinΑ. Καθένα από αυτά τα συμπλέγματα πιστεύεται ότι λειτουργούν σε μια συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου και είναι υποστρωματικά . Έτσι, γεννήθηκε το ακόλουθο μοντέλο: Στην πρώιμη G1 φαση, η Cdk4 και/ή Cdk6 ενεργοποιούνται από τις CyclinsD και αρχίζουν την φωσφορυλίωση της pRb. Αυτό ακολουθείται από την ενεργοποίηση του Cdk2 από την CyclinΕ, η οποία ολοκληρώνει τη φωσφορυλίωση της pRb οδηγώντας σε ενεργοποίηση της Ε2F μέσω μετεγγραφής, επιτρέποντας στα κύτταρα να μετακινηθούν στη φάση S.
Ο αναδιπλασιασμός του DNA ελέγχεται εν μέρει από σύμπλοκα Cdk2/ CyclinΑ. Η δραστηριότητα Cdc2/CyclinA ωθεί τα κύτταρα μέσω της φάσης G2. Η μέγιστη δραστηριότητα των συμπλεγμάτων Cdc2/ CyclinΒ είναι στη συνέχεια υπεύθυνη για τη μίτωση και την αδρανοποίηση της Cdc2/CyclinΒ η οποία είναι προϋπόθεση για τα κύτταρα που εξέρχονται από τη μίτωση.
Αυτό το μοντέλο βασίστηκε σε πολλά πειράματα σε διάφορα συστήματα (ποντίκι, άνθρωπος, Xenopus, Drosophila, κλπ.) Που χρησιμοποιούν κυρίως κύτταρα in vitro. Η πλειοψηφία των αποτελεσμάτων από αυτά τα πειράματα υποστήριζαν αυτό το κλασσικό μοντέλο αλλά μερικές φορές κάποια αποτελέσματα δεν ήταν συμβατά με αυτό το μοντέλο.

Αρχίζοντας τη δεκαετία του 1990, με μοντέλα knockout ποντικιών για τους ρυθμιστές κυτταρικού κύκλου, δημιουργήθηκαν και υπήρξε μια σιωπηρή παραδοχή ότι τέτοια knockouts θα μπορούσαν να αποδειχθούν εμβρυϊκά θανατηφόρα ή τουλάχιστον να εμφανίσουν σοβαρούς φαινότυπους. Ενδιαφέρον όμως είναι ότι πολλά από αυτά τα ποντίκια knockout ήταν βιώσιμα και εμφάνισαν συγκεκριμένους φαινότυπους. Τα ποντίκια Cdk4 -/- ήταν βιώσιμα, εμφάνισαν μικρό μέγεθος σώματος, μερική στειρότητα και ανάπτυσσαν αυθόρμητα σακχαρώδη διαβήτη. Ο κύριος λόγος για τον οποίο τα ποντίκια Cdk4 -/- ήταν βιώσιμα οφείλεται στην αντιστάθμιση του Cdk6. Αυτό επιβεβαιώθηκε αργότερα δείχνοντας ότι οι ποντικοί Cdk4 -/- Cdk6 -/- διπλού knockout πέθαιναν στην μήτρα.
Μια μεγάλη έκπληξη προήλθε όταν εμείς και μια άλλη ομάδα αναφέραμε ότι τα Cdk2 -/- ποντίκια ήταν βιώσιμα και ουσιαστικά φυσιολογικά εκτός από το να είναι στείρα. Το αποτέλεσμα αυτό δεν μπορούσε να εξηγηθεί και έθεσε σοβαρά ερωτήματα σχετικά με το τρέχον μοντέλο κυτταρικού κύκλου. Η πιο συνηθισμένη εξήγηση ήταν ότι “κάτι” αντισταθμίζει τις λειτουργίες του Cdk2.
Προσθήκη στη σύγχυση ήταν ο ρόλος της CyclinΕ, η οποία θεωρήθηκε ότι δεσμεύεται αποκλειστικά με Cdk2. Οι CyclinE1 -/- και CyclinΕ2 -/- σε ποντίκια με διπλό knockout αναφέρθηκαν ότι είναι εμβρυϊκά θανατηφόρες.
Επιπλέον, οι CyclinΕ1 -/- και CyclinΕ2 -/- MEF πολλαπλασιάζονται αλλά δεν εισέρχονται στη φάση S μετά την

ενεργειακή εξάντληση τροφής (starvation)

διατηρώντας την φάση G0.
Η διαφορά μεταξύ του φαινοτύπου Cdk2 -/- και CyclinΕ1 -/- και CyclinΕ2 -/- ήταν δύσκολο να εξηγηθεί. Σε ποντίκια Cdk2 -/-, η δραστηριότητα της CyclinΕ δεν ήταν δυνατό να ανιχνευθεί. Συνεπώς, εικάζεται ότι η CyclinΕ, μπορεί να έχει ουσιαστικές μη-καταλυτικές λειτουργίες ή έναν άγνωστο εταίρο κινάσης με διαφορετική εξειδίκευση υποστρώματος. Αυτή η εξήγηση δεν ήταν αδύνατη, αλλά φάνηκε πολύ καλά για τους περισσότερους από εμάς. Πώς θα μπορούσε να επιλυθεί αυτή η κατάσταση; Το μοντέλο του κυτταρικού μας κύκλου αναπτύχθηκε με σχεδόν τελειότητα από τα αποτελέσματα πολλών επιστημόνων για δύο δεκαετίες. Φαινόταν απίθανο να λείπει ένας βασικός ρυθμιστικός ρυθμιστής κυκλικού κύκλου για το Cdk2.

Σε μια νέα δημοσίευση στο Nature Cell Biology, παρέχουμε μια πιθανή εξήγηση για τον ήπιο φαινότυπο σε ποντίκια Cdk2 -/-: αν και η δραστηριότητα της CyclinΕ δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε Cdk2 -/- ποντικούς, καταφέραμε να την ανιχνεύσουμε σε εκχυλίσματα Cdk2 -/- p27 -/- ποντικών.
Επίσης, αποδείξαμε ότι η Cdc2 δεσμεύει την κυκλίνη Ε και σχηματίζει ένα ενεργό σύμπλοκο, οδηγώντας τα κύτταρα σε φάση S. Επομένως, η Cdc2 λειτουργεί στη μετάβαση φάσης G1/S (καθώς και στη μίτωση) και μπορεί να υποκαταστήσει το Cdk2.
Για να εξηγήσουμε τις λεπτομέρειες αυτού του ευρήματος, ας συνοψίσουμε συνοπτικά τα αποτελέσματα της μελέτης μας: δημιουργήσαμε Cdk2 -/- p27 -/- διπλά knockout ποντίκια και βρήκαμε ότι αυτοί οι ποντικοί εμφανίζουν όλους τους φαινοτύπους Cdk2-/- και p27-/- μονού knockout ποντικών.
Η ελλιπής γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ p27 και Cdk2 ήταν αινιγματική δεδομένου ότι λίγοι θα αμφιβάλλουν ότι το p27 δεσμεύει και αναστέλλει Cdk2. Έχει αποδειχθεί ότι η δραστηριότητα Cdk2 αυξάνεται απουσία του p27.
Στον θύμο αδένα και στον σπλήνα ποντικών Cdk2 -/- p27 -/-, ανιχνεύσαμε υψηλά επίπεδα φάσης S και μίτωση. Αυτό έδειξε ότι το p27 ρυθμίζει μια πρωτεΐνη που μπορεί να προάγει τη φάση S και τη μίτωση απουσία Cdk2. Επιδείξαμε ότι η p27 δεσμεύεται σε σύμπλοκα Cdc2 και ρυθμίζει τη δραστηριότητα της Cdc2, CyclinΑ και CyclinB παρουσία ή απουσία Cdk2.
Η έκπληξη ήταν ότι ανιχνεύσαμε αυξημένη δραστηριότητα CyclinΕ στα εκχυλίσματα Cdk2 -/- p27 -/-. Επομένως, ο λόγος για τον οποίο δεν μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε τη δράση της CyclinΕ πριν (σε εκχυλίσματα Cdk2 -/-) ήταν η παρουσία του p27, ο οποίος είναι ένας ισχυρός αναστολέας συμπλοκών CyclinΕ. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι το Cdc2 σχηματίζει ένα σύμπλεγμα με την CyclinΕ, η οποία αναστέλλεται από το p27. Ωστόσο, η ερώτηση παρέμεινε εάν οι λειτουργίες Cdc2 είναι επίσης απαραίτητες στη φάση S εκτός από τη σημασία της στη μίτωση.
Χρησιμοποιήσαμε shRNA για τη διακοπή δράσης της Cdc2 σε wild type και Cdk2 -/- MEFs και μπορούσαμε να δείξουμε ότι αυτά τα κύτταρα εισέρχονται στη φάση S λιγότερο αποτελεσματικά. Επομένως, απουσία Cdk2, η δραστηριότητα Cdc2 είναι απαραίτητη για την είσοδο στη φάση S.

Η σημασία του Cdc2 στο G1/S προκαλεί έκπληξη και θέτει μια σειρά νέων ερωτήσεων. Εάν το Cdc2 μπορεί να οδηγήσει τα κύτταρα από τη G1 σε μίτωση, γιατί υπάρχει ανάγκη για Cdk2; Μια παρόμοια και πιο αινιγματική ερώτηση αφορά τις διαφορές στην ρύθμιση των υποστρωμάτων της Cdk2 όπως οι CyclinE,A,B έναντι των συμπλεγμάτων Cdc2 /CyclinE,A,B.
Η απλούστερη απάντηση είναι ότι το Cdc2 ρυθμίζει μόνο το G1/S όταν το Cdk2 απουσιάζει. Παρ ‘όλα αυτά, βρήκαμε όλα αυτά τα σύμπλοκα Cdc2 σε κύτταρα άγριου τύπου κύτταρα21 που δείχνουν ότι σχηματίζονται παρουσία Cdk2. Είναι πιθανό η Cdk2 να διαδραματίζει μόνο σημαντικό ρόλο στη μείωση αλλά όχι στη μίτωση; Αν και αυτό είναι δυνατό, φαίνεται απίθανο.
Η ελάτωση της Cdk2 και Cdc2 στο G1/S μπορεί να αντανακλά τα πλεονεκτήματα για την πρόληψη μιας βλάβης λόγω μεταλλάξεων ή λανθασμένης ρύθμισης. Εάν η ελάτωση στην G1/S ήταν επιθυμητή, θα περίμενε κανείς τον ίδιο στην μίτωση. Στη μίτωση, το Cdk2 δεν μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια του Cdc2 αν και πρόσφατα αποδείξαμε ότι η Cdk2 δεσμεύει την CyclinΒ.
Μπορεί να υπάρξει πλεονασμός στη μίτωση που διέπεται από μια άλλη οδό από την Cdk2. Στους ποντικούς Cdk2 -/- p27 -/- (καθώς και p27 -/-), παρατηρήσαμε υψηλά επίπεδα δράσης Cdc2.
Παρά την υψηλή Cdc2 δραστηριότητα, αυτά τα κύτταρα δεν μπαίνουν σε μίτωση υποδεικνύοντας μια εναλλακτική οδό παρεμπόδισης της εισόδου σε μίτωση. Θα ήταν επίσης ενδιαφέρον να γνωρίζουμε γιατί ο Cdk2 δεν μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια του Cdc2, δεδομένου ότι και οι δύο δεσμεύουν τις ίδιες κυκλίνες. Τουλάχιστον στην εκκολαπτόμενη ζύμη, το Cdk2 θηλαστικού (καθώς και το Cdk3) μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια του Cdc28p5,26,27 συμπεριλαμβανομένου κατά τη διάρκεια της μίτωσης

Ενδιαφέρον όμως είναι ότι το Cdk2 δεν μπορεί να αντισταθμίσει το cdc2 στη ζύμη ζαχαρμύκητα. Αυτή η διαφορά μεταξύ μαγιάς και σχισίματος ζύμης προκαλεί σύγχυση και μπορεί να αντανακλά πειραματικές διαφορές.
Μια άλλη ερώτηση σχετικά με τις λειτουργίες του Cdc2 στο G1/S αφορά τον υποκυτταρικό εντοπισμό του. Το Cdc2 έχει εντοπιστεί στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της G1/S/G2 και εισέρχεται στον πυρήνα μετά τη διάσπαση του πυρηνικού ελάσματος.
Ο κυτταροπλασματικός εντοπισμός του Cdc2 κατά τη διάρκεια της G1/S θα απέκλειε μια λειτουργία στην αντιγραφή του DNA και στην αλληλεπίδραση με την CyclinΕ και Α Οι περισσότερες από τις μελέτες εντοπισμού βασίζονται σε πειράματα ανοσοφθορισμού ή κλασμάτωσης, τα οποία δεν μπορούν να αποκλείσουν ότι ένα μικρό ποσοστό Cdc2 είναι πυρηνικό κατά τη διάρκεια G1/ . Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να αντιμετωπίσουν αυτό το ζήτημα.

Σύμφωνα με το κλασσικό μοντέλο κυτταρικού κύκλου, οι λειτουργίες p27 έχουν τονιστεί κατά τη διάρκεια της G1/S φάσης μετάπτωσης αντί της G2/M. Αν και το p27 δεσμεύει όλα τα Cdks, έχει περιγραφεί ως ένας ισχυρός αναστολέας της CyclinΕ/Cdk2 και της CyclinA/Cdk2.
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η δραστηριότητα CyclinD/Cdk4 απαιτείται για τη φωσφορυλίωση του Rb και την απελευθέρωση των παραγόντων μεταγραφής E2F, που οδηγεί στην ενεργοποίηση των γονιδίων που απαιτούνται για την είσοδο φάσης S, όπως η CyclinΕ. Η p27 δεσμεύει την CyclinD/Cdk4, αλλά πιστεύεται ότι είναι ένας σταθεροποιητής παρά ένας αναστολέας, επειδή αυτό το σύμπλοκο παραμένει καταλυτικά ενεργό σε αντίθεση με τα συμπλέγμα CyclinΕ/Cdk2/p27, τα οποία είναι πάντοτε ανενεργά. Επομένως, κατά τη διάρκεια των G1 η CyclinD/Cdk4 η απομακρίνει την p27 μακριά από τα σύμπλοκα CyclinE/Cdk2, διατηρώντας τα ενεργά για να ολοκληρωθεί η φωσφορυλίωση του Rb. Η απελευθέρωση των E2F από την Rb και η επακόλουθη μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω της CyclinE παρέχουν ένα βρόχο θετικής ανάδρασης για να οδηγούν τα κύτταρα στη φάση S. Επιπλέον, η CyclinE/Cdk2 πιστεύεται ότι φωσφορυλιώνει την p27 την θέση Thr187, η οποία προκαλεί την ουδετεροποίηση και την αποικοδόμηση των κυττάρων όπως η φάση S.
Οι λειτουργίες του p27 κατά τη διάρκεια της G1/S απεικονίζονται σε MEFs ανεπαρκή για Cdk4.
Cdk4 -/- MEFs παρουσιάζουν καθυστέρηση στην είσοδο φάσης S μετά από ηρεμία ταυτόχρονα με καθοδική ρύθμιση της δράσης Cdk2. Όταν η p27 αφαιρέθηκε από τα ποντίκια Cdk4 -/-, αποκαταστάθηκε η καθυστέρηση στην είσοδο φάσης S στα p27 -/- Cdk4 -/- MEFs. Αυτό εξηγείται ως εξής: στα Cdk4 -/- MEF τα περισσότερα από τα διαθέσιμα p27 είναι σύμπλοκα με Cdk2 λόγω της απουσίας Cdk4 και αυτό αναστέλλει τα σύμπλοκα Cdk2 στη μετάβαση G1/S. Αλλά όταν η p27 αφαιρεθεί σε Cdk4 -/- MEF η Cdk2 δραστηριότητα αποκαθίσταται και η κανονική κινητική φάσης S συνεχίζεται.
Ωστόσο, το γεγονός ότι η είσοδος φάσης S στα Cdk4 -/- MEFs δεν αναστέλλεται πλήρως, αλλά καθυστερεί μόνο, μπορεί να αντανακλά ότι το σύμπλοκο Cdc2/CyclinΕ ρυθμίζει τη μετάβαση G1/S εν μέρει παράλληλα με το Cdk2, όπως δείξαμε πρόσφατα.
Επίσης φαίνεται ότι το p27 δεσμεύει Cdk2 πιο αποτελεσματικά από το Cdc2 in vitro.
Επομένως, το μεγαλύτερο μέρος της συγκέντρωσης p27, που έγινε διαθέσιμη κατά την δικοπή του Cdk4, ανακατανέμεται στο Cdk2, αναστέλλοντάς το, αλλά η παράλληλη οδός που ρυθμίζεται από Cdc2/CyclinE μπορεί να παραμένει ενεργή εξαιτίας της σύνεσης με το p27 με λιγότερη αποτελεσματικότητα σε αυτό το σύμπλεγμα.

Πρόσφατα, ο ρόλος του p27 ως αρνητικός ρυθμιστής κυτταρικού κύκλου επεκτάθηκε την G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου.
Nakayama et al. δημιούργησαν ποντίκια που έχουν έλλειψη της φάση S κινάσης συνδεδεμένης για τη πρωτεΐνη 2 (Skp2). Η Skp2 είναι μέλος των Fbox πρωτεϊνών, οι οποίες είναι υπομονάδες
των λιγκασών ουβικιτίνης SCF. Το Skp2 είναι που απαιτείται για την αποικοδόμηση της p27. Τα Skp2 -/- ποντίκια παρουσιάζουν φαινότυπους που είναι αντίθετα από εκείνα των p27 -/- ποντικών38 λόγω αυξημένων επιπέδων των p27 παρατηρούνται σε αυτούς τους ποντικούς. Τα κύτταρα Skp2 -/- έδειξαν μεγάλους πυρήνες, πολυπλοειδίας και υπερδιέγερσης κεντροσωμάτων.
Όταν ποντίκια Skp2 -/- υποβλήθηκαν σε μερική ηπατεκτομή, τα ηπατοκύτταρα αυξήθηκαν σε μέγεθος αλλά όχι σε αριθμό εξαιτίας της αδυναμίας εισόδου στη μίτοση.

Στους Skp2 -/- ποντικούς που δεν είχαν p27 (Skp2-/- p27-/-), αυτοί οι φαινότυποι διασώθηκαν και τα κύτταρα επανέκτησαν την ικανότητα να εισέλθουν στη μίτωση.

Επομένως, υποτίθεται ότι όταν το Skp2 αφαιρεθεί, το p27 συσσωρεύει και αναστέλλει τόσο το Cdk2 όσο και το Cdc2. Η παρεμπόδιση του Cdc2 οδηγεί σε αποτυχία στην είσοδο της μίτωσης. Όταν η p27 αφαιρεθεί από τα Skp2 -/- ποντίκια, η δραστηριότητα του Cdc2 διατηρείται και τα κύτταρα εισέρχονται στη μίτωση. Τα συμπεράσματα του Nakayama αναφορικά με την αναστολή της Cdc2 από την p27 επιβεβαιώθηκαν στο μοντέλο μας p27 -/- Cdk2 -/- ποντικού, στο οποίο αποδείξαμε ότι το p27 δεσμεύει σύμπλοκα Cdc2, κυκλίνης Β, Α2, Ε και suc1. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν μια κεντρική ρόλος του p27 στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των θηλαστικών. Το p27 ρυθμίζει τις δραστηριότητες και των δύο Cdk2 σε σύμπλεγμα με την κυκλίνη Α, Ε, Β καθώς και Cdc2 σε σύμπλεγμα με την κυκλίνη Α, Ε, Β, ελέγχοντας έτσι τα μηχανήματα φάσης S και M.
 
Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μετάβαση φάσης G1/S ελέγχεται από δύο παράλληλες οδούς, το ένα είναι Cdk2 και το άλλο Cdc2. Συνεπώς, η αναστολή μόνο της Cdk2 ή Cdc2 έχει μικρή επίδραση στη φάση S αλλά θα ευαισθητοποιήσει το σύστημα για αναστολή της άλλης κινάσης. Αυτό θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα θεραπευτικό παράθυρο που δεν έχει εξερευνηθεί ακόμη. Παρόλα αυτά, πρέπει να έχουμε κατά νου ότι το Cdc2 πιθανότατα έχει επιπλέον βασικές λειτουργίες στη μίτωση. Ένα άλλο ζήτημα που δεν έχει αντιμετωπιστεί είναι η διαφορά στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μεταξύ της φυσιολογικής ανάπτυξης και της ανάπτυξης του όγκου. Είναι καθιερωμένο ότι τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν μεταλλάξεις και ενισχύσεις σε ρυθμιστές κυτταρικού κύκλου. Είναι ακόμη πιθανό ότι το πρότυπο των μεταλλάξεων και/ή των ενισχύσεων είναι ειδικό για κάθε όγκο. Μέχρι στιγμής, τα περισσότερα ποντίκια Cdk knockout έχουν αναλυθεί μόνο για φυσιολογική ανάπτυξη. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να εξετάσουν εάν η απώλεια των Cdks επηρεάζει την ανάπτυξη και ανάπτυξη του όγκου. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό αφού έχει αποδειχθεί ότι τα Cdk4 -/- και τα κυκλίνη D1 -/- ποντίκια είναι μερικώς ανθεκτικά στην ογκογένεση.
Στην παρούσα επισκόπηση παρουσιάζουμε ένα νέο μοντέλο για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των θηλαστικών. Προτείνουμε ότι οι λειτουργίες των διαφορετικών συμπλοκών Cdk/Cyclins δεν περιορίζονται σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου όπως προτείνεται στο κλασικό μοντέλο ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, αλλά μάλλον συνεργάζονται μεταξύ τους για να πραγματοποιήσουν κάποια λειτουργία. Για παράδειγμα, οι Cdk2/CyclinΕ και Cdc2/CyclinΕ μπορούν να ρυθμίζουν τη μετάπτωση φάσης G1/S παράλληλα. Επομένως, τα Cdk2 και Cdc2 μπορεί να είναι ίσα αδέλφια τουλάχιστον στο G1/S, αν και το Cdc2 έχει ισχυρή μιτωτική λειτουργία. Προτείνουμε επίσης έναν κεντρικό ρόλο για το p27 στη ρύθμιση των μεταπτώσεων φάσης G1/S και G2/M λόγω της ικανότητάς του να αναστέλλει αμφότερα τα σύμπλοκα Cdk2 και Cdc2. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, τα θηλαστικά ανέπτυξαν διαφορετικά σύμπλοκα Cdks και κυκλίνης, αλλά στην πραγματικότητα ο κυτταρικός κύκλος των θηλαστικών μπορεί να εξακολουθήσει να ζει μόνο με Cdc2 και κυκλίνη Β και Α2, μια κατάσταση που θυμίζει τον κυτταρικό κύκλο των ζυμών. Ο λειτουργικός πλεονασμός πολλών Cdks προστατεύει την ακεραιότητα του κύκλου κυτταρικής διαίρεσης σε περίπτωση που κάποιο από τα σύμπλοκα αποτύχει για οποιονδήποτε λόγο.
 
Philipp Kaldis
Eiman Aleem
National Cancer Institute; Mouse Cancer Genetics Program; Frederick, Maryland USA

https://doi.org/10.4161/cc.4.11.2124

Καθώς το κύτταρο εξελίσσεται μέσω G2 και φτάνει στη μετάβαση G2/M, η κινάση Plk1 φωσφορυλιώνει το Wee1, το οποίο στοχεύει την Wee1 για αποικοδόμηση μέσω του συμπλόκου SCF λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης.
Μία επιπλέον λειτουργία του Plk1 είναι η ενεργοποίηση του Cdc25 μέσω φωσφορυλίωσης. Το σύνθετο αποτέλεσμα της αποικοδόμησης Wee1 και της ενεργοποίησης Cdc25 είναι η καθαρή απομάκρυνση της ανασταλτικής φωσφορυλίωσης από cdc2, η οποία ενεργοποιεί το cdc2.

H Plk1 ενεργοποιείται στη μετάβαση G2/M από τα Aurora Α και Bora, τα οποία συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια της G2 και σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα ενεργοποίησης. Το σύμπλοκο Plk1-Cdc2-cdc25 ξεκινά έπειτα έναν βρόχο θετικής ανάδρασης ο οποίος χρησιμεύει για την περαιτέρω ενεργοποίηση του Cdc2 και σε συνδυασμό με μια αύξηση στα επίπεδα της Cyclin-Β κατά τη διάρκεια της G2, τα προκύπτοντα συμπλέγματα cdc2:Cyclin-Β ενεργοποιούν έπειτα παρακάτω στόχους οι οποίοι προάγουν την είσοδο στην μίτωση.

figure

The G2/M DNA damage checkpoint prevents the cell from entering mitosis (M phase) if the genome is damaged. The Cdc2-cyclin B kinase is pivotal in regulating this transition. During G2 phase, Cdc2 is maintained in an inactive state by the kinases Wee1 and Myt1. As cells approach M phase, the phosphatase Cdc25 is activated, perhaps by the polo-kinase Plk1. Cdc25 then activates Cdc2, establishing a feedback amplification loop that efficiently drives the cell into mitosis. DNA damage activates the DNA-PK/ATM/ATR kinases, initiating two parallel cascades that inactivate Cdc2-cyclin B. The first cascade rapidly inhibits progression into mitosis: the CHK kinases phosphorylate and inactivate Cdc25, which can no longer activate Cdc2. The second cascade is slower. Phosphorylation of p53 dissociates it from MDM2, activating its DNA binding activity. Acetylation by p300/PCAF further activates its transcriptional activity. The genes that are turned on by p53 constitute effectors of this second cascade. They include 14-3-3s, which binds to the phosphorylated Cdc2-cyclin B kinase and exports it from the nucleus; GADD45, which apparently binds to and dissociates the Cdc2-cyclin B kinase; and p21, an inhibitor of a subset of the cyclin-dependent kinases including Cdc2 (CDK1)

 

Η προκύπτουσα δραστηριότητα Cdk1 ενεργοποιεί επίσης την έκφραση Meml-Fkh, ενός μεταβατικού γονιδίου G2/M.
Η ταχεία αύξηση της δραστηριότητας της Cyclin-Β:Cdk1 είναι απαραίτητη, καθώς η έναρξη της φάσης Μ είναι ένα συμβάν “όλα ή τίποτα” που εμπλέκεται σε υστέρηση. Η υστέρηση της δραστηριότητας Cdk1 μέσω της Cyclin-Β οδηγεί στην είσοδο φάσης Μ με τον καθορισμό ενός ελάχιστου ορίου συγκέντρωσης Cyclin-Β. Αυτό υπάρχει σε επίπεδο υψηλότερο από το ελάχιστο που απαιτείται για τη συνέχιση της φάσης Μ μετά την είσοδο, ενεργώντας για την προστασία του γεγονότος “όλα ή τίποτα”. Αυτή η συγκέντρωση εισόδου αυξάνεται περαιτέρω στην περίπτωση μη πλήρους αντιγραφής του DNA, προσθέτοντας έναν άλλο ρυθμιστικό μηχανισμό στο σημείο μετάβασης G2/M. Η παρουσία της υστέρησης επιτρέπει την είσοδο της φάσης Μ να ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό ως συνάρτηση της δραστηριότητας της cyclin-B:Cdk1.

Οι μηχανισμοί με τους οποίους εμποδίζεται η μιτωτική είσοδος σε απάντηση βλάβης του DNA είναι παρόμοιες με εκείνες στο σημείο ελέγχου G1/S.

Η βλάβη του DNA ενεργοποιεί την ενεργοποίηση της προαναφερθείσας οδού ATM/ATR, στην οποία η ATM (Ataxia telangiectasia mutated)/ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3 related) φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τις κινάσες ελέγχου Chk1/Chk2. Chk1/2 φωσφορυλιώνεται το cdc25 το οποίο, εκτός από το ότι αναστέλλεται, απομονώνεται επίσης στο κυτταρόπλασμα με τις πρωτεΐνες 14-3-3. Οι πρωτεΐνες 14-3-3 ρυθμίζονται προς τα πάνω από την p53, η οποία, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ενεργοποιείται από Chkl και ATM/ATR. Η p53 επίσης ενεργοποιεί το p21 και αμφότερα το p21 και τις πρωτείνες 14-3-3 όπου με τη σειρά τους αναστέλλουν τα σύμπλοκα Cyclin-B:cdc2 διαμέσου της φωσφορυλίωσης και της κυτταροπλασματικής απομόνωσης του cdc2. Επιπλέον, η αδρανοποίηση του cdc25 καταλήγει στην ανικανότητά του να αποφωσφορυλιώνει και να ενεργοποιεί το cdc2.
Τέλος, ένας άλλος μηχανισμός αντίδρασης βλάβης είναι μέσω της αρνητικής ρύθμισης του Plk1 με ATM/ATR, η οποία με τη σειρά του έχει ως αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση των Wee1 και Myt1, τα οποία στη συνέχεια φωσφορυλιώνουν και αναστέλλουν το cdc2, διατηρώντας έτσι το κύτταρο συγκρατημένο στην G2 μέχρις ότου η βλάβη αποκατασταθεί.

Διατηρώντας το Σημείο Ελέγχου

Το Rad3 απαιτείται για την ενεργοποίηση του Chkl και την έναρξη της διακοπής της G2, αλλά πιστεύεται ότι οι διαφορετικές πρωτεΐνες διατηρούν τη διακοπή της G2 έτσι ώστε να μπορεί να εμφανιστεί επαρκής επισκευή του DNA.

Μία τέτοια πρωτεΐνη είναι rad18 που απαιτείται για τη διακοπή της G2 ακόμα και όταν η Chkl είναι φωσφορυλιωμένη και ενεργή.

Επομένως, το rad18 απαιτείται για τη συντήρηση του G2/M στο σημείο ελέγχου, ενώ η Chk1 απαιτείται για την έναρξη του σημείου ελέγχου.

Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από την πρόσθετη λειτουργία της στην επισκευή του DNA, ειδικά στη διατήρηση των χρωμοσωμικών δομών. Η αναγκαιότητά της αποδεικνύεται από το γεγονός ότι, ελλείψει rad18, το DNA δεν είναι σε θέση να επιδιορθωθεί ακόμη και όταν η σύλληψη G2 παρατείνεται με άλλα μέσα.

Η διατήρηση μιας τέτοιας ανακοπής στη φάση G2 υποστηρίζεται περαιτέρω από τα p53 και p21. Απουσία του p53 ή p21, αποδείχθηκε ότι τα ακτινοβολημένα κύτταρα προχώρησαν σε μίτωση. Η απουσία p21 ή 14-3-3 δεν μπορεί να αναστείλει επαρκώς το σύμπλοκο CyclinB-Cdc2, παρουσιάζοντας έτσι τον ρυθμιστικό έλεγχο των p53 και p21 στο σημείο ελέγχου G2 σε απάντηση της βλάβης του DNA. Οι μεταλλάξεις p53 μπορούν να οδηγήσουν σε ένα σημαντικό έλλειμμα σημείου ελέγχου, το οποίο έχει σημαντικές επιπτώσεις στη θεραπεία του καρκίνου.

Απενεργοποίηση σημείου ελέγχου

Η απενεργοποίηση και των δύο Wee1 και Cdc25 καταργεί το σημείο ελέγχου της βλάβης του DNA G2-M. Η απουσία Wee1 ή η απομάκρυνση της θέσης τυροσίνης-15 απομακρύνει την αρνητική ρύθμιση της Cdc2 δραστικότητας και προκαλεί την είσοδο των κυττάρων στην μίτωση χωρίς την ολοκλήρωση της αποκατάστασης, πράγμα που καταργεί αποτελεσματικά το σημείο ελέγχου G2-M. Η απουσία Cdc25 αναστέλλει τα κύτταρα στο G2, αλλά εξακολουθεί να επιτρέπει την ενεργοποίηση του G2-M σημείου ελέγχου, εμπλέκοντας ότι τόσο η ενεργοποίηση του Wee1 όσο και η απενεργοποίηση του Cdc25 ως σημαντικά ρυθμιστικά βήματα στο σημείο ελέγχου.

Η απενεργοποίηση του Chk1 αρκεί για να ξεπεράσει το σημείο ελέγχου και να προωθήσει την είσοδο στη μίτωση, ανεξάρτητα από το εάν επιδιορθώνεται η βλάβη του DNA. Ωστόσο, λίγα είναι ακόμη γνωστά σχετικά με τον ακριβή μηχανισμό που αφορά τον τερματισμό του σημείου ελέγχου με πιθανούς μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνικών φωσφατασών αναστρέφοντας τις ενεργοποιούμενες φωσφορυλιώσεις, με στόχο την αποικοδόμηση ουμπικουϊτίνης ενεργοποιητικών πρωτεϊνών και ανταγωνιστών σημείων ελέγχου που προάγουν τη μίτωση μέσω ανεξάρτητων οδών.

———–
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4569015/
Control of cell cycle transcription during G1 and S phases (PMID: 23877564)

https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle_checkpoint