Dr. Ιάκωβος Θεοδοσίου MD. DipU

Ιατρός Διαιτολόγος

καρκίνος & διατροφή

διαιτολογική μεταβολική προσέγγιση
στην θεραπεία του καρκίνου

Menu

MPF (Maturation Promoting Factor)

Ο παράγοντας προαγωγής ωρίμανσης MPF, (ή ο παράγοντας προαγωγής της μιτώσεως ή ο παράγοντας προαγωγής της φάσης Μ) είναι το σύμπλοκο cyclin-Cdk που ανακαλύφθηκε αρχικά σε αυγά βατράχων.
Διεγείρει τις μιτωτικές και μειοτικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Ο MPF προωθεί την είσοδο στη μίτωση (φάση Μ) από τη φάση G2 με φωσφορυλίωση πολλαπλών πρωτεϊνών που χρειάζονται κατά τη διάρκεια της μίτωσης.
O MPF ενεργοποιείται στο τέλος του G2 από μια φωσφατάση, η οποία απομακρύνει μια ανασταλτική φωσφορική ομάδα που προστέθηκε νωρίτερα.
Το MPF ονομάζεται επίσης κινάση φάσης Μ λόγω της ικανότητάς του να φωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες στόχους σε ένα συγκεκριμένο σημείο του κυτταρικού κύκλου και έτσι να ελέγχει την ικανότητά τους να λειτουργούν.

Πράγματι, χρειάστηκε πολύς χρόνος, πριν αποδειχθεί ότι η MPF είναι πρωτεϊνική κινάση και ότι είναι ένα ετεροδιμερές, που περιλαμβάνει ένα μόριο κυκλίνης και ένα μόριο Cdc2. Η γνώση αυτή αποκτήθηκε τελικά όταν το συνδεδεμένο με Cdc2 συστατικό του καθαρισμένου αστεροειδούς MPF αναλύθηκε και βρέθηκε να είναι η CyclinΒ. Αυτή η θεμελιώδης ανακάλυψη επιβεβαιώθηκε σε σπονδυλωτά και μέλη θηλαστικών με την οικογένεια πρωτεϊνών Cdc2, να δεσμεύονται με κυκλίνες.
Τελικά η Cdc2 γίνεται Cdk1 και η πρώτη εξαρτώμενη από κυκλίνη πρωτεϊνική κινάση που ανακαλύφθηκε.

Οι κυκλίνες αρχικά αναγνωρίστηκαν ως πρωτεΐνες των οποίων η αφθονία ταλαντεύεται κυκλικά κατά τους κυτταρικούς κύκλους και η σύνδεσή τους με τον παράγοντα προαγωγής της ωρίμανσης MPF (maturation-promoting factor), ελέγχει την είσοδο στη φάση Μ, του κυτταρικού κύκλου.

Η ιδέα ότι οι Cdc2 και οι κυκλίνες παίζουν βασικό ρόλο στον έλεγχο της μετάπτωσης G2/M του κυτταρικού κύκλου προήλθαν σε μεγάλο βαθμό από τη γενετική ανάλυση της ζύμης ζαχαρομύκητα (Schizosaccharomyces pombe: fission yeast), μελετών των αχιβάδων, βατράχων, αχινοειδών και ωαρίων αστερία. Ωστόσο, χρειάστηκε πολύς χρόνος για να συνειδητοποιήσουμε ότι το Cdc2 και οι κυκλίνες σχηματίζουν ένα στοιχειομετρικό σύμπλεγμα και ότι μια υπομονάδα κυκλίνης είναι απαραίτητη για την Cdc2 υπομονάδα για να αποκτήσει τη δραστικότητα πρωτεϊνικής κινάσης.

Οι δύο κύριες διαδικασίες που είναι κοινές σε όλους τους κυτταρικούς κύκλους είναι η φάση S, όταν πολλαπλασιάζονται τα χρωμοσώματα και η φάση Μ, όταν τα αναδιπλασιαζόμενα χρωμοσώματα διαχωρίζονται σε δύο θυγατρικά κύτταρα. Στους περισσότερους κυτταρικούς κύκλους, ένα χρονικό διάστημα, η φάση G1, διαχωρίζει την προηγούμενη κυτταρική διαίρεση από την αρχή της επόμενης φάσης S.
Τώρα έχει εδραιωθεί σταθερά ότι η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου – δηλαδή, οι μεταβάσεις μεταξύ μίας φάσης του κύκλου και της επόμενης – ελέγχεται από CDKs. Αυτή η έννοια της άμεσης συσχέτισης μεταξύ μιας υπομονάδας κυκλίνης και μιας υπομονάδας κινάσης κυτταρικού κύκλου (Cdc2) προέκυψε από την ανάλυση της μετάβασης G2/M.
Οι μεταλλάξεις της ζύμης ζαχαρομύκητα που προωθούνταν πρόωρα στη μίτωση και εισέρχονται στην πρόφαση (prophase) ήταν μειωμένου μεγέθους και εστιόζοντας την προσοχή στο Cdc2, δεν έδωσαν ενδείξεις για τις κυκλίνες. Οι εκκολαπτόμενες μαγιές, ήταν λιγότερο ευνοϊκές για διερεύνηση στην μετάβασης G2/M αφού η ανάπτυξη συμβαίνει κυρίως στη φάση G1, η προσοχή επικεντρώνεται σε μεγάλο βαθμό στη μετάβαση G1/S. Έτσι, παραδόξως, ο πλούτος των πληροφοριών σχετικά με τα γονίδια του κυτταρικού κύκλου στο S. cerevisiae παρείχε αρχικά μόνο περιορισμένο αριθμό ενδείξεων για την τοποθέτηση των κυκλικών μαζί με CDKs. Αντίθετα, οι προσπάθειες για τον καθαρισμό και τον εντοπισμό του μυστηριώδους MPF (Masui and Markert, 1971) ήταν υψίστης σημασίας στο δρόμο προς την παρούσα κατανόηση του G2/M και, κατ ‘επέκταση, άλλων μεταβάσεων του κυτταρικού κύκλου. Εδώ κοιτάμε πίσω σε αυτή την ηρωική εποχή και προσπαθούμε να καθορίσουμε με ακρίβεια πότε και πώς το Cdc2 έγινε Cdk1.


Ειδικοί ρόλοι των δύο μιτωτικών κυκλίνων σε σωματικά κύτταρα: Κυκλίνη Α ως ενεργοποιητής του παράγοντα προαγωγής της φάσης Μ

Specialized Roles of the Two Mitotic Cyclins in Somatic Cells: Cyclin A as an Activator of M Phase–promoting Factor
Tsz Kan Fung, Hoi Tang Ma, and Randy Y.C. Poon
Molecular Biology of the Cell Vol. 18, 1861–1873, May 2007

Ο ρόλος της CyclinΒ-CDC2 ως παράγοντος προαγωγής της φάσης Μ (ΜΡF) είναι καθιερωμένος, αλλά οι ακριβείς λειτουργίες της CyclinΑ παραμένουν ένα κρίσιμο εκκρεμές ζήτημα. Εδώ δείχνουμε ότι η μείωση της CyclinΑ επάγει μια διακοπή φάσης G2 μέσω μιας ανεξάρτητης από το σημείο ελέγχου απενεργοποίησης της CyclinΒ-CDC2 με ανασταλτική φωσφορυλίωση.
Ο φαινότυπος διασώθηκε με την δημιουργία CyclinΑ ανθεκτικής σε παρεμβολές του RNA. Αντίθετα, η μείωση της CyclinΒ διακόπτει τη μίτωση χωρίς αδρανοποίηση της CyclinΑ/Cdk, υποδεικνύοντας ότι η CyclinΑ/Cdk συμβάλωντας στην αύξηση της CyclinΒ-CDC2. Ακόμη και όταν εκφράζεται εκτοπικά, η CyclinΑ δεν μπορεί να αντικαταστήσει την CyclinΒ στην κινητική μίτωση, υποδεικνύοντας τον ειδικό ρόλο της CyclinΒ ως συστατικού του MPF.
Η απορύθμιση του WEE1, αλλά όχι του άξονα PLK1-CDC25, μπορεί να υπερισχύσει της διακοπής που προκλήθηκε από την αποκοπή της CyclinΑ, υποδηλώνοντας ότι η CyclinΑ-Cdk μπορεί να προσκρούει στην ισορροπία της CyclinΒ-CDC2 ξεκινώντας την αδρανοποίηση του WEE1. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η CyclinΑ δεν μπορεί να σχηματίσει MPF ανεξάρτητα από την CyclinΒ και υπογραμμίζει τον κρίσιμο ρόλο της κυκλίνης ως ενεργοποιητή για την ενεργοποίηση του MPF.

Ανασκόπηση

Οι κλασσικές μελέτες του κυτταρικού κύκλου κορυφώθηκαν τη δεκαετία του ’80, στην προσπάθεια καθαρισμού του παράγοντα προαγωγής της φάσης Μ (MPF) στα αυγά Xeno-pus και στα ωοκύτταρα αστερία και την ταυτοποίηση των συστατικών του ως CyclinΒ και CDC2 (επίσης αποκαλούμενη Cyclin dependent kinase-1 [Cdk1 ] (αναθεωρημένη στο Doree and Hunt, 2002).
Η CyclinΒ συσσωρεύεται από τη φάση S και σχηματίζει ένα σύμπλοκο με το CDC2. Το σύμπλεγμα διατηρείται ανενεργό με φωσφορυλίωση του CDC2 Thr14/Tyr15 από τους MYT1 και WEE1 μέχρι να ενεργοποιηθεί απότομα από το CDC25 κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Καθώς το κύτταρο εξέρχεται από τη μίτωση, η CyclinΒ καταστρέφεται μέσω ενός μηχανισμού διαμεσολαβούμενου από ουβικιτίνη που καταλύεται από το APC/C (ανασκόπηση στο Fung and Poon, 2005).
Η CyclinΒ/CDC2 καταλύει την ενεργοποίησή της από ένα περίπλοκο δίκτυο βρόχων ανατροφοδότησης. Το WEE1 φωσφορυλιώνεται από Cdks, διευκολύνοντας την αποικοδόμησή του από τις λιγάσες ουβικουϊτίνης SCF(TrCP) και SCF(Tome-1) (Ayad et al., 2003, Watanabe et al., 2004, 2005, Harvey et al., 2005).
Η φωσφατάση CDC25C ενεργοποιείται με πολλαπλή φωσφορυλίωση Cdks (ανασκόπηση στο Hutchins and Clarke, 2004) και απενεργοποιείται με φωσφορυλίωση σε Ser216 (που εφαρμόζεται από αρκετές κινάσες, συμπεριλαμβανομένων των C-TAK1, CHK1 και CHK2). Αυτή η φωσφορυλίωση δημιουργεί μία θέση πρόσδεσης 14-3-3, η οποία καλύπτει μια εγγύς πυρηνικής ακολουθίας εντοπισμού και αποκλείει το CDC25C από τον πυρήνα.
Περαιτέρω, η φωσφορυλίωση του CDC25C Ser214 αναστέλλει τη φωσφορυλίωση του CDC25C Ser216 (Bulavin et αl., 2003). Έτσι, το MPF είναι ουσιαστικά ένα δισταθές σύστημα (Ferrell, 2002) που γίνεται αυτοκαταλυτικό όταν ενεργοποιείται ένα κρίσιμο τμήμα.

PP2A as a master regulator of the cell cycle
Hidden content

Αυτό που ενεργοποιεί την αρχική ενεργοποίηση του MPF έχει αποτελέσει αντικείμενο τεράστιας διαμάχης. Η πρωτεΐνη PLK1 (polo-like kinase 1) είναι υποψήφια δεδομένου ότι μπορεί να φωσφορυλιώσει το CDC25C στις εξαγωγές πυρηνικών ακολουθιών (NES) και να προάγει τη συσσώρευση του CDC25C στον πυρήνα (Toyoshima-Morimoto et al., 2002).
Το PLK1 φωσφορυλιώνει επίσης το NES της CyclinΒ και αυξάνει την πυρηνική συσσώρευσή του (Toyoshima-Morimoto et al., 2001, Yuan et al., 2002), συντονίζοντας τον εντοπισμό τόσο της CyclinΒ όσο και της CDC25C στον πυρήνα.
Τέλος, η PLK1 μπορεί επίσης να φωσφορυλιώσει και να αναστείλει το WEE1 (van Vugt and Medema, 2004 · Watanabe et al., 2005).

A nuclear export signal (NES) is a short amino acid sequence of 4 hydrophobic residues in a protein that targets it for export from the cell nucleus to the cytoplasm through the nuclear pore complex using nuclear transport. It has the opposite effect of a nuclear localization signal, which targets a protein located in the cytoplasm for import to the nucleus. The NES is recognized and bound by exportins.
Nuclear export first begins with the binding of Ran-GTP (a G-protein) to exportin. This causes a shape change in exportin, increasing its affinity for the export cargo. Once the cargo is bound, the Ran-exportin-cargo complex moves out of the nucleus through the nuclear pore. GTPase activating proteins (GAPs) then hydrolyze the Ran-GTP to Ran-GDP, and this causes a shape change and subsequent exportin release. Once no longer bound to Ran, the exportin molecule loses affinity for the nuclear cargo as well, and the complex falls apart. Exportin and Ran-GDP are recycled to the nucleus separately, and guanine exchange factor (GEF) in the nucleus switches the GDP for GTP on Ran.

Η CyclinΑ είναι στενά σχετιζόμενη σε ακολουθία με την CyclinΒ, αλλά δεν υπήρχε στα καθαρισμένα κλάσματα MPF από ωάρια και αυγά. Οι ακριβείς λειτουργίες της CyclinΑ παραμένουν ελάχιστα καθορισμένες.
Δύο Cyclins τύπου Α, η Α1 (εμβρυϊκή μορφή) και η Α2 (σωματική μορφή), υπάρχουν σε ανώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η διακοπή της CyclinΑ1 σε ποντίκια οδηγεί σε έναν ήπιο φαινότυπο (ένα μπλοκ της πρώτης μειωτικής διαίρεσης σε αρσενικούς ποντικούς, Liu et al., 1998), που πιστοποιεί ότι η CyclinΑ1 δεν αποτελεί συστατικό του βασικού ΜΡF σε εμβρυϊκά κύτταρα. Αντίθετα, η διάσπαση της CyclinΑ2 προκαλεί πρώιμη εμβρυϊκή θνησιμότητα (Murphy et al., 1997), υποδηλώνοντας διαταραχή του κυτταρικού κύκλου για την CyclinΑ σε σωματικά κύτταρα.
Η CyclinΑ συσσωρεύεται από την πρώιμη φάση S και εξαφανίζεται σιγά σιγά πριν από την CyclinΒ κατά τη διάρκεια της μίτωσης (ανασκόπηση στο Yam et al., 2002). Επίσης, σε αντίθεση με την CyclinΒ, η CyclinΑ μπορεί να προσδένεται και σε CDC2 και Cdk2. Η επικρατούσα άποψη είναι ότι η CyclinΑ έχει σημαντικές λειτουργίες στη φάση S, πιθανώς για τη συσσώρευση του CDC45 σε προέλευση αντιγραφής και για την εξαρτώμενη από τη φωσφορυλίωση διάσπαση του παράγοντα αδειοδότησης Cdk6 (ανασκόπηση στο Woo and Poon, 2003). Επίσης, ευρέως ισχύει ότι η CyclinΑ έχει κρίσιμες λειτουργίες στη μίτωση, αλλά ο ακριβής ρόλος της δεν είναι πλήρως κατανοητός (ανατρέξτε στο Fung and Poon, 2005).
Για να αποκρυπτογραφήσουμε τον ρόλο της κυκλίνης Α σε σωματικά κύτταρα, είμαστε τώρα σε θέση να προσεγγίσουμε το πρόβλημα χρησιμοποιώντας αντίστροφη γενετική, βασισμένη στην εισαγωγή RNAi. Για να γίνει διάκριση εάν η ίδια η CyclinΑ αποτελεί συστατικό του ΜΡF ή είναι μέρος του μηχανισμού που ενεργοποιεί το MPF, η CyclinΑ και η CyclinΒ διακόπηκαν και μελετήθηκε η απαίτηση τους κατά την μίτωση. Βρήκαμε ότι η καθυστέρηση G2 που προκαλείται από την απουσία CyclinΑ προκλήθηκε από την αδρανοποίηση της CyclinΒ/CDC2 με ανασταλτική φωσφορυλίωση. Αυτός ο φαινότυπος θα μπορούσε να αναστραφεί με έκφραση του RNAi-ανθεκτικά της CyclinΑ.
Αυξημένη έκφραση της CyclinΒ ή μη φωσφορυλιωμένη CDC2 μπορούσε να ξεπεράσει διακοπή της CyclinΑ. Αντιθέτως, βρήκαμε ότι εκτοπικά εκφραζόμενη CyclinΑ δεν θα μπορούσε να αντικαταστήσει CyclinΒ στην κινητική μίτωση. Τέλος, παρουσιάζουμε στοιχεία ότι μεταξύ των ρυθμιστών φωσφορυλίωσης CDC2, η απορρύθμιση του WEE1 επέτρεψε την ενεργοποίηση της CyclinΒ/CDC2 ακόμη και εν απουσία της CyclinΑ. Αυτές οι παρατηρήσεις υπογραμμίζουν έναν κρίσιμο ρόλο της κυκλίνης Α ως ενεργοποιητή για την ενεργοποίηση του MPF.

Κυκλίνες ως ενεργοποιητές MPF

Τα πλήρως αναπτυγμένα ωοκύτταρα που διεγείρονται με ειδικά σήματα (μερικές φορές ορμόνες, μερικές φορές με γονιμοποίηση) περνούν από τη φάση G2 και εισέρχονται στη φάση Μ. Από αυτή τη στιγμή, το κυτταρόπλασμα τους, έχει αποκτήσει δραστηριότητα MPF ακόμη και σε απουσία πρωτεϊνικής σύνθεσης (Wasserman and Masui, 1975), και οδηγεί τα ωοκύτταρα-δέκτες σε φάση Μ, ακόμη και όταν μεταφέρονται σε ωοκύτταρα που έχουν διακοπεί η φάση G2.
Ένα από τα πιο δραματικά γεγονότα που ακολουθούν την ορμονική διέγερση στα ωοκύτταρα αστερία και των αμφιβίων είναι η φωσφορυλίωση πρωτεϊνών, η οποία σχετίζεται με αυξημένες δραστικότητες πρωτεϊνικής κινάσης (Guerrier et al., 1977, Maller et αl., 1977).
Το 1983 η μεγάλη έκταση της πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης στα ωοκύτταρα αστερία έδειξε να ταλαντώνεται (υφέσεις και εξάρσεις επιπέδων συγκέντρωσης) ταυτόχρονα με τη δραστηριότητα του MPF κατά τη διάρκεια της μειωτικής ωρίμανσης. Ενώ τα υψηλά και τα χαμηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών συνδέονται με υψηλά και χαμηλά επίπεδα δράσης MPF αντίστοιχα (Dorée et αl., 1983).
Την ίδια χρονιά, ο Wagenaar ανέλυσε την χρονική στιγμή της σύνθεσης των πρωτεϊνών που απαιτούνται για την μίτωση στους πρώιμους κυτταρικούς κύκλους των εμβρύων αχινών θάλασσας (Wagenaar, 1983), εκτείνοντας προηγούμενες αναφορές ότι η προστιθέμενη puromycin κατά τη διάρκεια της γονιμοποίησης αποτρέπει την πρώτη διαίρεση (Hultin, 1961). Αυτό απέδειξε ότι απαιτείται πρωτεϊνική σύνθεση σε κάθε κυτταρικό κύκλο για τη συμπύκνωση χρωμοσωμάτων και τη διάσπαση του πυρηνικού περιβλήματος και συνεπώς για να συμβεί η μετάβαση φάσης G2/M.
Διαπιστώθηκε επίσης ότι, η σύνθεση πρωτεϊνών απαιτείται, σε ωοκύτταρα Xenopus για την επανεμφάνιση της δραστικότητας του MPF στον δεύτερο μειωτικό κύκλο των κυττάρων ή στο πρώιμο έμβρυο μετά τη γονιμοποίηση και την παρθενογενετική ενεργοποίηση (Gerhart et αl., 1984).
Η παρατήρηση ότι μια ταυτόχρονη ταλάντωση της δραστικότητας του MPF και μιας μείζονος ανεξάρτητης από cAMP ανεξάρτητης κινάσης ιστόνης, η οποία εξαρτάται από την πρωτεϊνική σύνθεση, και την αποικοδόμηση πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της μειοτικής ωρίμανσης ωοκυττάρων αστεροειδούς, οδήγησαν στην προκλητική πρόταση.
Ότι, η μη αναστρέψιμη διαδικασία πρωτεόλυσης μπορεί να εμπλέκεται στην περιοδική αδρανοποίηση μιας κύριας κινάσης του κυκλώματος και την πτώση της δραστικότητας του MPF κατά την έξοδο από τη φάση Μ (Picard et αl., 1985). Προφανώς, τα χαρακτηριστικά αυτά θυμίζουν τις κυκλίνες, οι οποίες είχαν ταυτοποιηθεί το 1983 καθώς πρωτεΐνες υποβαθμίστηκαν στο τέλος κάθε κύκλου Μ-φάσης στο πρώιμο έμβρυο θαλάσσιου αχινού (Evans et al., 1983).

Η άποψη ότι οι μιτωτικές κυκλίνες συνδέονται κατά κάποιον τρόπο με τις ταλαντώσεις στις δραστικότητες της ΜΡF και της μιτωτικής κινάσης ενισχύθηκε όταν αποδείχθηκε ότι η έκφραση της κυκλίνης Α της αχιβάδας απελευθερώνει ωοκύτταρα Xenopus από τη διακοπή της G2 και προκαλεί μειωτική φάση Μ απουσία ορμονικής διέγερσης (Swenson et al., 1986).
Δύο χρόνια αργότερα, οι Murray και Kirschner πέτυχαν να παράγουν εκχυλίσματα “κυκλικά” αυγών βατράχων που εκτελούν πολλαπλούς κυτταρικούς κύκλους in vitro (Murray and Kirschner, 1989). Έδειξαν ότι, μετά την καταστροφή των ενδογενών κυτταρικών mRNAs, που αναστέλλει τα εκχυλίσματα σε ενδιάμεση φάση, η προσθήκη εξωγενούς mRNA κυκλίνης επαρκεί για την παραγωγή πολλαπλών κυτταρικών κύκλων. Επιπλέον, παρατηρούν ότι η νεοσυντιθέμενη κυκλίνη υποβαθμίζεται στο τέλος κάθε μίτωσης (Murray and Kirschner, 1989).
Η άποψη ότι η σύνθεση της CyclinΒ είναι απαραίτητη για τους κύκλους των μιτωτικών κυττάρων κατά την διάσπαση των εμβρύων Xenopus, καθιερώθηκε όταν ο Minshull et αl., αναγνώρισε δύο κυκλίνες, ως κύρια προϊόντα μετάφρασης, σε εκχυλίσματα απαλλαγμένα κυττάρων, ανέφεραν ότι η προκαλούμενη καταστροφή αυτών των mRNAs εμποδίζει την είσοδο στη μίτωση (Minshull et αl., 1989α).

Μαζί, αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι η κυκλίνη είναι απαραίτητη για την εμφάνιση του MPF και ότι ο MPF εξαφανίζεται εξαιτίας της καταστροφής της κυκλίνης. Επιπλέον, έδειξαν έντονα ότι η δραστηριότητα του MPF συνδέεται στενά με την δραστηριότητα μιτωτικών κινασών των οποίων οι ταλαντώσεις μοιράζονται με το MPF τις ίδιες απαιτήσεις για πρωτεϊνική σύνθεση και αποικοδόμηση.

Παράλληλα με τις προαναφερθείσες έρευνες, δύο άλλες ομάδες χρησιμοποίησαν in vitro φωσφορυλίωση των ιστονών ως δοκιμασία για τον καθαρισμό με συμβατική χρωματογραφία στήλης της κύριας μιτωτικής κινάσης από ωοκύτταρα αστεροειδούς (Arion et αl., 1988, Labbé κ.ά., 1988). Χρησιμοποιώντας PSTAIRE ανοσοκηλίδωση και / ή σύνδεση με p13suc1, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ήταν η Cdc2 κινάση. Επειδή το Cdc2 φαίνεται να είναι ένα συστατικό του Xenopus MPF, Arion et αl. πρότεινε ότι η Cdc2 κινάση και η MPF θα μπορούσαν να είναι η ίδια οντότητα, αν και δεν αντιμετώπισαν αυτό το ζήτημα πειραματικά. Ωστόσο, αυτή η ερμηνεία ήταν δύσκολο να συμβιβαστεί με το γεγονός ότι, αν και τα εμπύρηνα ωοκύτταρα αστεροειδών ήδη ενεργοποιημένα από την Cdc2 κινάση, ως απάντηση ορμονικής διέγερσης, δεν παράγουν μεταβιβάσιμη δραστηριότητα MPF (Kishimoto et αl., 1981, Picard et αl., 1984, Picard et αl., 1988).

Από το Cdc2 στο Cdk1
Cdc2 και κυκλίνες ως αλληλεπιδρώντες πρωτεΐνες

Χρησιμοποιώντας ακατέργαστα ομογενοποιημένα έμβρυα πρώιμης αχιβάδας, βρέθηκε ότι οι κυκλίνες συν-ανοσο-καθιζάνουν με δραστικότητα κινάσης Cdc2 (Draetta et αl., 1989). Η Cdc13, η κύρια κυκλίνη σε μαγιά ζαχαρομύκητα, έδειξε στη συνέχεια να συν-καθιζάνει με την Cdc2 και να διαχωρίζεται από την Cdc2 στην περιοριστική θερμοκρασία σε cdc13-117 θερμοευαίσθητα μεταλλάγματα (Booher et αl., 1989). Αυτό υποδήλωνε ότι οι κυκλίνες θα μπορούσαν να είναι υπομονάδες της Cdc2 κινάσης, ακόμη και αν η Cdc2 διατήρησε τη δράση της κινάσης της Η1 στην περιοριστική θερμοκρασία (Moreno et αl., 1989). Η εναλλακτική πιθανότητα ήταν ότι οι κυκλίνες είναι μιτωτικά υποστρώματα Cdc2 και στην πραγματικότητα αποδείχθηκε ότι υφίστανται φωσφορυλίωση όταν προστίθεται [γ-32Ρ] ΑΤΡ σε υλικά που διατηρούνται σε σφαιρίδια ρ135υ1. Ωστόσο, εναντίον αυτής χρησιμοποιήθηκε μια άλλη μελέτη που χρησιμοποίησε πρόωρα έμβρυα αχινούς, η οποία έδειξε ότι η κυκλίνη Β συν-καθαρίζεται με Cdc2 κινάση κατά μήκος αρκετών σταδίων στήλης χρωματογραφίας (Meijer et αl, 1989). Αυτό ευνόησε την πρώτη ερμηνεία.

Κατά το ίδιο έτος, αναφέρθηκε ότι οι σχετικές πρωτεΐνες θα μπορούσαν προφανώς να απομακρυνθούν από την Cdc2 χωρίς απώλεια της δραστηριότητάς τους κινάσης ιστόνης μετά από εκτεταμένο καθαρισμό από ωοκύτταρα αστερίας (Labbé κ.ά., 1989α). Αν και αυτό δεν υποδήλωνε απόλυτη απαίτηση για πρωτεΐνη ενεργοποιητή που σχετίζεται με Cdc2, η κυκλίνη θα μπορούσε να υποστεί πρωτεόλυση κατά τη διάρκεια της μακράς διαδικασίας καθαρισμού, έτσι ώστε να μην ανιχνεύθηκε κανένα θραύσμα σταθερού μεγέθους με δράση Cdc2 κινάσης ακόμη και όταν τα διαδοχικά κλάσματα χρωματίστηκαν σε άργυρο ανάλυση με SDS-PAGE στο τελικό παρασκεύασμα. Ούτε ήταν αυτοφωσφορυλίωση οποιουδήποτε πολυπεπτιδίου που ανιχνεύθηκε στην τελική κορυφή δραστηριότητας όταν η κινάση επωάστηκε με [γ-32Ρ] ΑΤΡ. εν τούτοις, ένα θραύσμα κυκλίνης που στερείται των θέσεων φωσφορυλίωσης θα μπορούσε ακόμα να συνδεθεί με Cdc2. Η μικροέγχυση αυτής της εξαιρετικά καθαρισμένης Cdc2 κινάσης απελευθέρωσε εύκολα τα ωοκύτταρα από τη διακοπή της G2 σε μια ποικιλία ειδών. Εκπληκτικά, το έπραξε ακόμη και σε αστερίες, αν και η φυσική Cdc2 κινάση δεν είναι επαρκής (απουσία πυρηνικού υλικού) για να προκαλέσει διάσπαση φυσαλιδώδους κυστιδίου σε ωοκύτταρα αστερία που δεν διεγείρονται από ορμόνες.

Την εποχή εκείνη είχαν ταυτοποιηθεί μόνο μερικές πρωτεϊνικές κινάσες που περιείχαν ρυθμιστικές υπομονάδες και το παράδειγμα για αυτές τις κινάσες ήταν η εξαρτώμενη από cAMP πρωτεϊνική κινάση (ΡΚΑ), της οποίας η ρυθμιστική υπομονάδα είχε δειχθεί ότι έχει αρνητικό έλεγχο της δραστικότητας της καταλυτικής υπομονάδας. Έτσι, ακόμη και για τους ανθρώπους που είναι πεπεισμένοι ότι το MPF ήταν πράγματι πρωτεϊνική κινάση, ο θετικός ρόλος που η κυκλίνη φαινόταν να έχει στη ρύθμιση της δράσης του MPF δεν υποδήλωνε ότι ήταν αναγκαστικά μια υπομονάδα αυτής της κινάσης. Στην πραγματικότητα, κανένας φαινότυπος δεν συσχετίστηκε με υπερέκφραση Cdc13 σε ζύμη σχάσης (Booher and Beach, 1988).

Η κινάση MPF θεωρήθηκε μάλλον ότι διατηρείται ανενεργή μέσω σύνδεσης με μια υποθετική ανασταλτική υπομονάδα: η σύνδεση της κυκλίνης προτάθηκε για να διαχωριστεί η ανασταλτική υπομονάδα (anti-MPF) και να ενεργοποιηθεί η κινάση (Minshull et αϊ., 1989b) (Εικ. 1). Σε συμφωνία με αυτή την άποψη, μια οντότητα αντι-ΜΡΡ που ονομάζεται INH (για αναστολέα ενίσχυσης ΜΡΡ) είχε χαρακτηριστεί σε ωοκύτταρα Xenopus (Cyert and Kirschner, 1988). Επιπλέον, ο αρνητικός έλεγχος της Cdc2 κινάσης μέσω φωσφορυλίωσης έχει αποδειχθεί τόσο στα ωοκύτταρα αστερίας όσο και στα ωοκύτταρα Xenopus (Labbé κ.ά., 1989α, Dunphy and Newport, 1989, Gautier et αϊ., 1989), η οποία ήταν σύμφωνη με γενετικές μελέτες σε μαγιά σχάσης αποδεικνύοντας ότι η κινάση Wee1 αρνητικά ελέγχει την Cdc2 κινάση (Russell and Nurse, 1987). Επομένως, η κυκλίνη θα μπορούσε να ελέγξει την ενεργοποίηση του MPF προκαλώντας την αποφωσφορυλίωση του Cdc2 [ότι η κυκλίνη είναι ήδη συνδεδεμένη με Cdc2 πριν από την αποφωσφορυλίωση της από το Cdc25c αποδείχθηκε μόνο δύο χρόνια αργότερα (Gautier and Maller, 1991, Strausfeld κ.ά., 1991).

αποσαφήνιση του MPF αστερίας ως ετεροδιμερές κυκλίνης-Β-Cdc2

Labbé et αϊ. παρείχε αποφασιστική απόδειξη ότι η κυκλίνη Β είναι μια γνήσια υπομονάδα Cdc2 κινάσης όταν ανέφεραν καθαρισμό προς ομοιογένεια της κινάσης ειδικής φάσης Μ από ωοκύτταρα αστερίας στην πρώτη μειοτική μεταφάση χρησιμοποιώντας μια ταχεία διαδικασία τριών σταδίων που βασίζεται σε χρωματογραφία συγγένειας σε ακινητοποιημένη πρωτεΐνη ζύμης p13suc1 (Labbé et αl., 1989b). Εκτός από το p34cdc2, η τελική κορυφή της δραστικότητας κινάσης Η1 περιείχε μόνο ένα άλλο πολυπεπτίδιο, το οποίο είχε φαινομενικό μοριακό βάρος 47kDa και ταυτοποιήθηκε ως κυκλίνη Β αστεροειδούς με άμεση μικροσυστοιχία.

Όταν το τελικό παρασκεύασμα επωάστηκε με [γ-32Ρ] ΑΤΡ, η κυκλίνη Β σημάνθηκε εκτεταμένα. Το Cdc2 επισημάνθηκε σε πολύ μικρότερο βαθμό, εάν υπήρχε καθόλου. Όλα τα δραστικά κλάσματα περιείχαν τόσο Cdc2 όσο και κυκλίνη Β, και η τελευταία δεν ανιχνεύθηκε εκτός της κορυφής της δραστικότητας. Για να ενισχυθεί η άποψη ότι και οι δύο πρωτεΐνες συσχετίζονται σε ένα σύμπλεγμα, οι Labbé et αϊ. διαχωρίστηκε το Cdc2 από την κυκλίνη Β χρησιμοποιώντας μία στήλη αντίστροφης φάσης HPLC που αναπτύχθηκε με μια βαθμίδωση ακετονιτριλίου (Labbé et αϊ., 1989b). Με τον ποσοτικό προσδιορισμό της σχετικής απορρόφησης κάθε πρωτεΐνης με παρακολούθηση της απορρόφησης στα 220 nm, παρατηρήθηκε σταθερή στοιχειομετρία 1: 1 Cdc2 και κυκλίνης Β σε ανεξάρτητα παρασκευάσματα και σε διαδοχικά κλάσματα σε όλη την τελική κορυφή της δραστικότητας κινάσης. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καθαρισμένη κινάση είναι ένα ετεροδιμερές που περιέχει ένα μόριο Cdc2 και ένα μόριο κυκλίνης Β.

Η καθαρισμένη κινάση προκάλεσε εύκολα τη διάσπαση των βλαστικών κυψελίδων και τη μειοτική ωρίμανση όταν εγχύθηκε σε ωοκύτταρα Xenopus, γεγονός που ήταν σύμφωνο με την αναφερθείσα έλλειψη ζωολογικής ειδικότητας του MPF (Kishimoto et al., 1982). Επιπλέον, αργότερα αποδείχθηκε ότι προκαλεί μειοτική ωρίμανση σε ωοκύτταρα αστερίας μόνο όταν μικροεγχύεται στον πυρήνα. Όταν εγχύθηκε στο κυτταρόπλασμα, υποβλήθηκε σε γρήγορη απενεργοποίηση, όπως και η φυσική κινάση όταν μεταφέρεται από ωοκύτταρα που έχουν πυρηνική δόση (Picard et αϊ., 1991). Έτσι, η ετεροδιμερής Cdc2 κινάση συμπεριφέρθηκε διαφορετικά από την προηγούμενη παρασκευή (Labbé et αϊ., 1989α), όπου η Cdc2 ήταν η μόνη κύρια πρωτεΐνη.

Όταν ήταν διαθέσιμα αντισώματα κατά της ανασυνδυασμένης κυκλίνης Β αστεροειδούς (Strausfeld κ.ά., 1991), θα μπορούσε να αποδειχθεί ότι η κυκλίνη Β υφίσταται πρωτεόλυση κατά τη διάρκεια της βαθμίδας διήθησης πηκτής της πρώτης διαδικασίας καθαρισμού, δημιουργώντας πολυάριθμα πολυπεπτιδικά θραύσματα, κανένα από τα οποία δεν υπάρχει σε επαρκή ποσότητες που ανιχνεύονται με χρώση αργύρου στο τελικό παρασκεύασμα. Τουλάχιστον ένα μέρος του κουτιού κυκλίνης διαφεύγει από την πρωτεόλυση, λόγω της δευτερεύουσας δομής του. Επειδή μόνο η Ν-τερματική περιοχή της κυκλίνης περιέχει θέσεις φωσφορυλίωσης, το τελικό παρασκεύασμα απέτυχε να αυτοφωσφορυλιώσει Cdc2-δεσμευμένα θραύσματα κυκλίνης. Επιπλέον, επειδή αυτή η περικομμένη κυκλίνη στερείται του Ν-τερματικού CRS (σήμα κυτταροπλασματικής συγκράτησης) και του NES (σήμα πυρηνικού αποκλεισμού) της κυκλίνης Β, το σύμπλοκο κινάσης μετατοπίζεται ταχέως στον πυρήνα των ωοκυττάρων δέκτη και διαφεύγει της κυτταροπλασματικής απενεργοποίησης όταν μικροενεγχύεται σε G2- . Αυτό πιθανότατα οφείλεται στην παράδοξα υψηλή δραστηριότητά του MPF στον αστερίας.

ένα CDK οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών

Ένα χρόνο αργότερα, η ταυτοποίηση της κυκλίνης-Β-Cdc2 ως MPF επεκτάθηκε στα ωοκύτταρα Xenopus: χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα κατά των κυκλινών Xenopus, Gautier et αϊ. έδειξαν ότι το υψηλής καθαρότητας παρασκεύασμα MPF που παρασκευάζεται από ωοκύτταρα σε δεύτερη μεταφάση (βλέπε παραπάνω) περιείχε ένα μίγμα κυκλίνης-Β1-Cdc2 και κυκλίνης-Β2-Cdc2 (Gautier et αϊ., 1990). Δεν ανιχνεύθηκε κυκλίνη-Α-Cdc2, αν και τα ωοκύτταρα παράγουν κυκλίνη Α στον δεύτερο κύκλο κυττάρων μελιτών. Το 1990 και το 1991, στενοί συγγενείς του Cdc2 ταυτοποιήθηκαν σε Drosophila και Xenopus (Lehner and O’Farrell, 1990, Paris et al., 1991). Κανένα από αυτά δεν θα μπορούσε να σώσει τη διακοπή κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από μεταλλάξεις σε cdc2 ή CDC28 σε ζυμομύκητες, αλλά οι Fang και Newport έδειξαν ότι η εκλεκτική εξάντληση της σχετικής με το Xenopus cdc2 πρωτεΐνης (γνωστή ως Eg-1 εκείνη την εποχή) μπορεί να καταστείλει την αντιγραφή του DNA στο αυγό Xenopus εκχυλίσματα, ένα εύρημα σε αντίθεση με την εξάντληση του Cdc2 (Fang and Newport, 1991). Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι ένας στενός συγγενής του Eg-1 στους ανθρώπους μπορεί να διασώσει τη διακοπή της G1 σε μεταλλάξεις ζυμομυκήτων που εκβάλλουν CDC28 αλλά όχι τη διακοπή της G2 σε μεταλλάγματα cdc2 ζύμης σχάσης (Ninomiya-Tsugi et αϊ., 1991, Elledge and Spottswood, 1991) . Αυτό απέδειξε ότι και οι δύο συγγενείς Cdc2 έχουν διαφορετικές λειτουργίες στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Και οι δύο έδειξαν ότι δεσμεύονται με την κυκλίνη Α. Όταν έγινε φανερό ότι ομόλογα Cdc2 θηλαστικών μπορούν επίσης να προσδεθούν στις κυκλίνες (Pines and Hunter, 1990), δημιουργήθηκε μια νέα σύμβαση για την ονομασία αυτών των κινάσεων με συναίνεση στο Συμπόσιο Cold Spring Harbor στο Cell Κύκλος το 1991: οι κινάσες που σχετίζονται με τις κυκλίνες θα ονομάζονταν «εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες» ή CDK. Και έτσι το Cdc2 έγινε Cdk1 …

http://jcs.biologists.org/content/115/12/2461.long

From Cdc2 to Cdk1: when did the cell cycle kinase join its cyclin partner?

Cell Cycle Sibling Rivalry “Cdc2 versus Cdk2”

Εδώ και καιρό πιστεύαμε ότι η Cdk2 δεσμεύεται από την CyclinE ή την CyclinA και προάγει αποκλειστικά τη μετάβαση της φάσης G1/S ενώ ότι το σύμπλοκο Cdc2/CyclinΒ παίζει σημαντικό ρόλο στη μίτωση. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η Cdc2 συνδέεται με την CyclinΕ (επιπλέον της CyclinΑ και CyclinΒ) και είναι σε θέση να προάγει τη μετάβαση G1/S.
Αυτή η νέα λογική υποδηλώνει ότι τόσο το Cdk2 όσο και το Cdc2 μπορούν να κατευθύνουν τα κύτταρα μέσω της φάσης G1/S παράλληλα.
Σε αυτήν την ανασκόπηση συζητούμε το κλασικό μοντέλο κυτταρικού κύκλου και το πώς τα αποτελέσματα από τα ποντίκια knockout παρέχουν νέα στοιχεία που αντικρούουν αυτό το μοντέλο. Εστιάζουμε στους ρόλους των Cdc2 και p27 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των θηλαστικών και προτείνουμε ένα νέο μοντέλο ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου που θα φιλοξενεί αυτά τα νέα ευρήματα.

Αρχίζοντας τη δεκαετία του 1990, με μοντέλα knockout ποντικιών για τους ρυθμιστές κυτταρικού κύκλου, δημιουργήθηκαν, και υπήρξε μια σιωπηρή παραδοχή ότι τέτοια knockouts θα μπορούσαν να αποδειχθούν εμβρυϊκά θανατηφόρα ή τουλάχιστον να εμφανίσουν περισσότερους φαινότυπους.
Ενδιαφέρον όμως είναι ότι πολλά από αυτά τα ποντίκια knockout ήταν βιώσιμα και εμφάνισαν συγκεκριμένους φαινότυπους. Τα ποντίκια Cdk4 -/- ήταν βιώσιμα, εμφάνισαν μικρό μέγεθος σώματος, μερική στειρότητα και ανάπτυσσαν αυθόρμητα σακχαρώδη διαβήτη. Ο κύριος λόγος για τον οποίο τα ποντίκια Cdk4 -/- ήταν βιώσιμα οφείλεται στην αντιστάθμιση του Cdk6. Αυτό επιβεβαιώθηκε αργότερα δείχνοντας ότι οι ποντικοί Cdk4 -/- Cdk6 -/- διπλού knockout πέθαιναν στην μήτρα.
Μια μεγάλη έκπληξη προήλθε όταν εμείς και μια άλλη ομάδα αναφέραμε ότι τα Cdk2 -/- ποντίκια ήταν βιώσιμα και ουσιαστικά φυσιολογικά εκτός από το να είναι στείρα. Το αποτέλεσμα αυτό δεν μπορούσε να εξηγηθεί και έθεσε σοβαρά ερωτήματα σχετικά με το τρέχον μοντέλο κυτταρικού κύκλου.

Οι Cdks προάγουν τις μεταβάσεις μεταξύ των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Οι cdks των θηλαστικών συνδέονται με συγκεκριμένες κυκλίνες, πχ, οι Cdk4 ή Cdk6 συνδέονται με τις Cyclins τύπου D, η Cdk2 δεσμεύεται με την CyclinΕ και CyclinΑ και η Cdc2 δεσμεύεται με την CyclinΒ και την CyclinΑ.
Καθένα από αυτά τα συμπλέγματα πιστεύεται ότι λειτουργούν σε μια συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου και είναι υποστρωματικά . Έτσι, γεννήθηκε το ακόλουθο μοντέλο: Στην πρώιμη G1 φαση, η Cdk4 και/ή Cdk6 ενεργοποιούνται από τις CyclinsD και αρχίζουν την φωσφορυλίωση της pRb. Αυτό ακολουθείται από την ενεργοποίηση του Cdk2 από την CyclinΕ, η οποία ολοκληρώνει τη φωσφορυλίωση της pRb οδηγώντας σε ενεργοποίηση της Ε2F μέσω μετεγγραφής, επιτρέποντας στα κύτταρα να μετακινηθούν στη φάση S.
Ο αναδιπλασιασμός του DNA ελέγχεται εν μέρει από σύμπλοκα Cdk2/ CyclinΑ. Η δραστηριότητα Cdc2/CyclinA ωθεί τα κύτταρα μέσω της φάσης G2. Η μέγιστη δραστηριότητα των συμπλεγμάτων Cdc2/ CyclinΒ είναι στη συνέχεια υπεύθυνη για τη μίτωση και την αδρανοποίηση της Cdc2/CyclinΒ η οποία είναι προϋπόθεση για τα κύτταρα που εξέρχονται από τη μίτωση.
Αυτό το μοντέλο βασίστηκε σε πολλά πειράματα σε διάφορα συστήματα (ποντίκι, άνθρωπος, Xenopus, Drosophila, κλπ.) Που χρησιμοποιούν κυρίως κύτταρα in vitro. Η πλειοψηφία των αποτελεσμάτων από αυτά τα πειράματα υποστήριζαν αυτό το κλασσικό μοντέλο αλλά μερικές φορές κάποια αποτελέσματα δεν ήταν συμβατά με αυτό το μοντέλο.

Η πιο συνηθισμένη εξήγηση ήταν ότι “κάτι” αντισταθμίζει τις λειτουργίες του Cdk2.
Προσθήκη στη σύγχυση ήταν ο ρόλος της CyclinΕ, η οποία θεωρήθηκε ότι δεσμεύεται αποκλειστικά με Cdk2. Οι CyclinE1 -/- και CyclinΕ2 -/- σε ποντίκια με διπλό knockout αναφέρθηκαν ότι είναι εμβρυϊκά θανατηφόρες.
Επιπλέον, οι CyclinΕ1 -/- και CyclinΕ2 -/- MEF (MEF’s are Mouse Embryo Fibroblasts) πολλαπλασιάζονται αλλά δεν εισέρχονται στη φάση S μετά την ενεργειακή εξάντληση της τροφής (starvation) διατηρώντας την φάση G0.

Η διαφορά μεταξύ του φαινοτύπου Cdk2 -/- και CyclinΕ1 -/- και CyclinΕ2 -/- ήταν δύσκολο να εξηγηθεί. Σε ποντίκια Cdk2 -/-, η δραστηριότητα της CyclinΕ δεν ήταν δυνατό να ανιχνευθεί. Συνεπώς, εικάζεται ότι η CyclinΕ, μπορεί να έχει ουσιαστικές μη-καταλυτικές λειτουργίες ή έναν άγνωστο εταίρο κινάσης με διαφορετική εξειδίκευση υποστρώματος. Αυτή η εξήγηση δεν ήταν αδύνατη, αλλά φάνηκε πολύ καλά για τους περισσότερους από εμάς. Πώς θα μπορούσε να επιλυθεί αυτή η κατάσταση; Το μοντέλο του κυτταρικού μας κύκλου αναπτύχθηκε με σχεδόν τελειότητα από τα αποτελέσματα πολλών επιστημόνων για δύο δεκαετίες. Φαινόταν απίθανο να λείπει ένας βασικός ρυθμιστικός ρυθμιστής κυκλικού κύκλου για το Cdk2.

Σε μια νέα δημοσίευση στο Nature Cell Biology, παρέχουμε μια πιθανή εξήγηση για τον ήπιο φαινότυπο σε ποντίκια Cdk2 -/-: αν και η δραστηριότητα της CyclinΕ δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε Cdk2 -/- ποντικούς, καταφέραμε να την ανιχνεύσουμε σε εκχυλίσματα Cdk2 -/- p27 -/- ποντικών.
Επίσης, αποδείξαμε ότι η Cdc2 δεσμεύει την κυκλίνη Ε και σχηματίζει ένα ενεργό σύμπλοκο, οδηγώντας τα κύτταρα σε φάση S. Επομένως, η Cdc2 λειτουργεί στη μετάβαση φάσης G1/S (καθώς και στη μίτωση) και μπορεί να υποκαταστήσει το Cdk2.
Για να εξηγήσουμε τις λεπτομέρειες αυτού του ευρήματος, ας συνοψίσουμε τα αποτελέσματα της μελέτης μας: δημιουργήσαμε Cdk2 -/- p27 -/- διπλά knockout ποντίκια και βρήκαμε ότι αυτοί οι ποντικοί εμφανίζουν όλους τους φαινοτύπους Cdk2-/- και p27-/- μονού knockout ποντικών.
Η ελλιπής γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ p27 και Cdk2 ήταν αινιγματική δεδομένου ότι λίγοι θα αμφιβάλλουν ότι το p27 δεσμεύει και αναστέλλει Cdk2. Έχει αποδειχθεί ότι η δραστηριότητα Cdk2 αυξάνεται απουσία του p27.
Στον θύμο αδένα και στον σπλήνα ποντικών Cdk2 -/- p27 -/-, ανιχνεύσαμε υψηλά επίπεδα φάσης S και μίτωση. Αυτό έδειξε ότι το p27 ρυθμίζει μια πρωτεΐνη που μπορεί να προάγει τη φάση S και τη μίτωση απουσία Cdk2. Επιδείξαμε ότι η p27 δεσμεύεται σε σύμπλοκα Cdc2 και ρυθμίζει τη δραστηριότητα της Cdc2, CyclinΑ και CyclinB παρουσία ή απουσία Cdk2.
Η έκπληξη ήταν ότι ανιχνεύσαμε αυξημένη δραστηριότητα CyclinΕ στα εκχυλίσματα Cdk2 -/- p27 -/-. Επομένως, ο λόγος για τον οποίο δεν μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε τη δράση της CyclinΕ πριν (σε εκχυλίσματα Cdk2 -/-) ήταν η παρουσία του p27, ο οποίος είναι ένας ισχυρός αναστολέας συμπλοκών CyclinΕ. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι το Cdc2 σχηματίζει ένα σύμπλεγμα με την CyclinΕ, η οποία αναστέλλεται από το p27. Ωστόσο, η ερώτηση παρέμεινε εάν οι λειτουργίες Cdc2 είναι επίσης απαραίτητες στη φάση S εκτός από τη σημασία της στη μίτωση.
Χρησιμοποιήσαμε shRNA για τη διακοπή δράσης της Cdc2 σε wild type και Cdk2 -/- MEFs μπορούσαμε να δείξουμε ότι αυτά τα κύτταρα εισέρχονται στη φάση S λιγότερο αποτελεσματικά. Επομένως, απουσία Cdk2, η δραστηριότητα Cdc2 είναι απαραίτητη για την είσοδο στη φάση S.

Η σημασία του Cdc2 στο G1/S προκαλεί έκπληξη και θέτει μια σειρά νέων ερωτήσεων. Εάν το Cdc2 μπορεί να οδηγήσει τα κύτταρα από τη G1 σε μίτωση, γιατί υπάρχει ανάγκη για Cdk2; Μια παρόμοια και πιο αινιγματική ερώτηση αφορά τις διαφορές στην ρύθμιση των υποστρωμάτων της Cdk2 όπως οι CyclinE,A,B έναντι των συμπλεγμάτων Cdc2 /CyclinE,A,B.
Η απλούστερη απάντηση είναι ότι το Cdc2 ρυθμίζει μόνο το G1/S όταν το Cdk2 απουσιάζει. Παρόλα αυτά, βρήκαμε όλα τα σύμπλοκα Cdc2 σε άγριου τύπου κύτταρα που δείχνουν ότι σχηματίζονται παρουσία Cdk2. Είναι πιθανό η Cdk2 να διαδραματίζει μόνο σημαντικό ρόλο στη μείωση αλλά όχι στη μίτωση; Αν και αυτό είναι δυνατό, φαίνεται απίθανο.
Η ελάττωση της Cdk2 και Cdc2 στο G1/S μπορεί να αντανακλά τα πλεονεκτήματα για την πρόληψη μιας βλάβης λόγω μεταλλάξεων ή λανθασμένης ρύθμισης. Εάν η ελάττωση στην G1/S ήταν επιθυμητή, θα περίμενε κανείς τον ίδιο στην μίτωση. Στη μίτωση, το Cdk2 δεν μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια του Cdc2 αν και πρόσφατα αποδείξαμε ότι η Cdk2 δεσμεύει την CyclinΒ.
Μπορεί να υπάρξει πλεονασμός στη μίτωση που διέπεται από μια άλλη οδό από την Cdk2. Στους ποντικούς Cdk2 -/- p27 -/- (καθώς και p27 -/-), παρατηρήσαμε υψηλά επίπεδα δράσης Cdc2.
Παρά την υψηλή Cdc2 δραστηριότητα, αυτά τα κύτταρα δεν μπαίνουν σε μίτωση υποδεικνύοντας μια εναλλακτική οδό παρεμπόδισης της εισόδου σε μίτωση. Θα ήταν επίσης ενδιαφέρον να γνωρίζουμε γιατί ο Cdk2 δεν μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια της Cdc2, δεδομένου ότι και οι δύο δεσμεύουν τις ίδιες κυκλίνες. Τουλάχιστον στην εκκολαπτόμενη ζύμη, το Cdk2 θηλαστικού (καθώς και το Cdk3) μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια του Cdc28p συμπεριλαμβανομένου κατά τη διάρκεια της μίτωσης

Ενδιαφέρον όμως είναι ότι η Cdk2 δεν μπορεί να αντισταθμίσει την Cdc2 στη ζύμη ζαχαρμύκητα. Αυτή η διαφορά μεταξύ μαγιάς και ζύμης ζαχαρμύκητα προκαλεί σύγχυση και μπορεί να αντανακλά πειραματικές διαφορές.
Μια άλλη ερώτηση σχετικά με τις λειτουργίες του Cdc2 στο G1/S αφορά τον υποκυτταρικό εντοπισμό του. Το Cdc2 έχει εντοπιστεί στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της G1/S/G2 και εισέρχεται στον πυρήνα μετά τη διάσπαση του πυρηνικού ελάσματος.
Ο κυτταροπλασματικός εντοπισμός του Cdc2 κατά τη διάρκεια της G1/S θα απέκλειε μια λειτουργία στην αντιγραφή του DNA και στην αλληλεπίδραση με την CyclinΕ και Α. Οι περισσότερες από τις μελέτες εντοπισμού βασίζονται σε πειράματα ανοσοφθορισμού ή κλασμάτωσης, τα οποία δεν μπορούν να αποκλείσουν ότι ένα μικρό ποσοστό Cdc2 είναι πυρηνικό κατά τη διάρκεια G1/ . Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να αντιμετωπίσουν αυτό το ζήτημα.

Σύμφωνα με το κλασσικό μοντέλο κυτταρικού κύκλου, οι λειτουργίες της p27 έχουν τονιστεί κατά τη διάρκεια της G1/S φάσης μετάπτωσης αντί της G2/M. Αν και το p27 δεσμεύει όλα τα Cdks, έχει περιγραφεί ως ένας ισχυρός αναστολέας της CyclinΕ/Cdk2 και της CyclinA/Cdk2.
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η δραστηριότητα CyclinD/Cdk4 απαιτείται για τη φωσφορυλίωση της pRb και την απελευθέρωση των παραγόντων μεταγραφής E2F, που οδηγεί στην ενεργοποίηση των γονιδίων που απαιτούνται για την είσοδο στην φάση S, όπως η CyclinΕ. Η p27 δεσμεύει την CyclinD/Cdk4, αλλά πιστεύεται ότι είναι ένας σταθεροποιητής παρά ένας αναστολέας, επειδή αυτό το σύμπλοκο παραμένει καταλυτικά ενεργό σε αντίθεση με τα συμπλέγμα CyclinΕ/Cdk2/p27, τα οποία είναι πάντοτε ανενεργά. Επομένως, κατά τη διάρκεια των G1 η CyclinD/Cdk4 απομακρίνει την p27 μακριά από τα σύμπλοκα CyclinE/Cdk2, διατηρώντας τα ενεργά για να ολοκληρωθεί η φωσφορυλίωση του ζύμη ζαχαρμύκητα pRb. Η απελευθέρωση των E2F από την pRb και η επακόλουθη μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω της CyclinE παρέχουν ένα βρόχο θετικής ανάδρασης για να οδηγούν τα κύτταρα στη φάση S. Επιπλέον, η CyclinE/Cdk2 πιστεύεται ότι φωσφορυλιώνει την p27 την θέση Thr187, για την ουβικουιτινοποίηση και αποικοδόμηση της καθώς τα κύτταρα μπαίνουν στην φάση S.
Οι λειτουργίες του p27 κατά τη διάρκεια της G1/S απεικονίζονται σε MEFs ανεπαρκή για Cdk4.
Cdk4 -/- MEFs παρουσιάζουν καθυστέρηση στην είσοδο φάσης S μετά από ηρεμία ταυτόχρονα με καθοδική ρύθμιση της δράσης Cdk2. Όταν η p27 αφαιρέθηκε από τα ποντίκια Cdk4 -/-, αποκαταστάθηκε η καθυστέρηση στην είσοδο φάσης S στα p27 -/- Cdk4 -/- MEFs. Αυτό εξηγείται ως εξής: στα Cdk4 -/- MEF τα περισσότερα από τα διαθέσιμα p27 είναι σύμπλοκα με Cdk2 λόγω της απουσίας Cdk4 και αυτό αναστέλλει τα σύμπλοκα Cdk2 στη μετάβαση G1/S. Αλλά όταν η p27 αφαιρεθεί σε Cdk4 -/- MEF η Cdk2 δραστηριότητα αποκαθίσταται και η κανονική κινητική φάσης S συνεχίζεται.
Ωστόσο, το γεγονός ότι η είσοδος φάσης S στα Cdk4 -/- MEFs δεν αναστέλλεται πλήρως, αλλά καθυστερεί μόνο, μπορεί να αντανακλά ότι το σύμπλοκο Cdc2/CyclinΕ ρυθμίζει τη μετάβαση G1/S εν μέρει παράλληλα με το Cdk2, όπως δείξαμε πρόσφατα.
Επίσης φαίνεται ότι το p27 δεσμεύει Cdk2 πιο αποτελεσματικά από το Cdc2 in vitro.
Επομένως, το μεγαλύτερο μέρος της συγκέντρωσης p27, που έγινε διαθέσιμη κατά την δικοπή του Cdk4, ανακατανέμεται στο Cdk2, αναστέλλοντάς το, αλλά η παράλληλη οδός που ρυθμίζεται από Cdc2/CyclinE μπορεί να παραμένει ενεργή εξαιτίας της σύνεσης με το p27 με λιγότερη αποτελεσματικότητα σε αυτό το σύμπλεγμα.

Πρόσφατα, ο ρόλος του p27 ως αρνητικός ρυθμιστής κυτταρικού κύκλου επεκτάθηκε την G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου.
Nakayama et al. δημιούργησαν ποντίκια που έχουν έλλειψη της κινάσης της φάση S συνδεδεμένης για τη πρωτεΐνη 2 (Skp2). Η Skp2 είναι μέλος των Fbox πρωτεϊνών, οι οποίες είναι υπομονάδες των λιγκασών ουβικιτίνης SCF. Το Skp2 είναι που απαιτείται για την αποικοδόμηση της p27. Τα Skp2 -/- ποντίκια παρουσιάζουν φαινότυπους που είναι αντίθετα από εκείνα των p27 -/- ποντικών38 λόγω αυξημένων επιπέδων των p27 παρατηρούνται σε αυτούς τους ποντικούς. Τα κύτταρα Skp2 -/- έδειξαν μεγάλους πυρήνες, πολυπλοειδίας και υπερδιέγερσης κεντροσωμάτων.
Όταν ποντίκια Skp2 -/- υποβλήθηκαν σε μερική ηπατεκτομή, τα ηπατοκύτταρα αυξήθηκαν σε μέγεθος αλλά όχι σε αριθμό εξαιτίας της αδυναμίας εισόδου στη μίτωση.

Στους Skp2 -/- ποντικούς που δεν είχαν p27 (Skp2-/- p27-/-), αυτοί οι φαινότυποι διασώθηκαν και τα κύτταρα επανέκτησαν την ικανότητα να εισέλθουν στη μίτωση.Επομένως, υποτίθεται ότι όταν το Skp2 αφαιρεθεί, το p27 συσσωρεύει και αναστέλλει τόσο το Cdk2 όσο και το Cdc2. Η παρεμπόδιση του Cdc2 οδηγεί σε αποτυχία στην είσοδο της μίτωσης. Όταν η p27 αφαιρεθεί από τα Skp2 -/- ποντίκια, η δραστηριότητα του Cdc2 διατηρείται και τα κύτταρα εισέρχονται στη μίτωση. Τα συμπεράσματα του Nakayama αναφορικά με την αναστολή της Cdc2 από την p27 επιβεβαιώθηκαν στο μοντέλο μας p27 -/- Cdk2 -/- ποντικού, στο οποίο αποδείξαμε ότι το p27 δεσμεύει σύμπλοκα Cdc2, κυκλίνης Β, Α2, Ε και suc1. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν μια κεντρική ρόλος του p27 στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των θηλαστικών. Το p27 ρυθμίζει τις δραστηριότητες και των δύο Cdk2 σε σύμπλεγμα με την κυκλίνη Α, Ε, Β καθώς και Cdc2 σε σύμπλεγμα με την κυκλίνη Α, Ε, Β, ελέγχοντας έτσι τα μηχανήματα φάσης S και M. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μετάβαση φάσης G1/S ελέγχεται από δύο παράλληλες οδούς, το ένα είναι Cdk2 και το άλλο Cdc2. Συνεπώς, η αναστολή μόνο της Cdk2 ή Cdc2 έχει μικρή επίδραση στη φάση S αλλά θα ευαισθητοποιήσει το σύστημα για αναστολή της άλλης κινάσης. Αυτό θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα θεραπευτικό παράθυρο που δεν έχει εξερευνηθεί ακόμη. Παρόλα αυτά, πρέπει να έχουμε κατά νου ότι το Cdc2 πιθανότατα έχει επιπλέον βασικές λειτουργίες στη μίτωση. Ένα άλλο ζήτημα που δεν έχει αντιμετωπιστεί είναι η διαφορά στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μεταξύ της φυσιολογικής ανάπτυξης και της ανάπτυξης του όγκου. Είναι καθιερωμένο ότι τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν μεταλλάξεις και ενισχύσεις σε ρυθμιστές κυτταρικού κύκλου. Είναι ακόμη πιθανό ότι το πρότυπο των μεταλλάξεων και/ή των ενισχύσεων είναι ειδικό για κάθε όγκο. Μέχρι στιγμής, τα περισσότερα ποντίκια Cdk knockout έχουν αναλυθεί μόνο για φυσιολογική ανάπτυξη. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να εξετάσουν εάν η απώλεια των Cdks επηρεάζει την ανάπτυξη και ανάπτυξη του όγκου. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό αφού έχει αποδειχθεί ότι τα Cdk4 -/- και τα κυκλίνη D1 -/- ποντίκια είναι μερικώς ανθεκτικά στην ογκογένεση.
Στην παρούσα επισκόπηση παρουσιάζουμε ένα νέο μοντέλο για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των θηλαστικών. Προτείνουμε ότι οι λειτουργίες των διαφορετικών συμπλοκών Cdk/Cyclins δεν περιορίζονται σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου όπως προτείνεται στο κλασικό μοντέλο ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, αλλά μάλλον συνεργάζονται μεταξύ τους για να πραγματοποιήσουν κάποια λειτουργία. Για παράδειγμα, οι Cdk2/CyclinΕ και Cdc2/CyclinΕ μπορούν να ρυθμίζουν τη μετάπτωση φάσης G1/S παράλληλα. Επομένως, τα Cdk2 και Cdc2 μπορεί να είναι ίσα αδέλφια τουλάχιστον στο G1/S, αν και το Cdc2 έχει ισχυρή μιτωτική λειτουργία. Προτείνουμε επίσης έναν κεντρικό ρόλο για το p27 στη ρύθμιση των μεταπτώσεων φάσης G1/S και G2/M λόγω της ικανότητάς του να αναστέλλει αμφότερα τα σύμπλοκα Cdk2 και Cdc2. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, τα θηλαστικά ανέπτυξαν διαφορετικά σύμπλοκα Cdks και κυκλίνης, αλλά στην πραγματικότητα ο κυτταρικός κύκλος των θηλαστικών μπορεί να εξακολουθήσει να ζει μόνο με Cdc2 και κυκλίνη Β και Α2, μια κατάσταση που θυμίζει τον κυτταρικό κύκλο των ζυμών. Ο λειτουργικός πλεονασμός πολλών Cdks προστατεύει την ακεραιότητα του κύκλου κυτταρικής διαίρεσης σε περίπτωση που κάποιο από τα σύμπλοκα αποτύχει για οποιονδήποτε λόγο. Philipp Kaldis
Eiman Aleem
National Cancer Institute; Mouse Cancer Genetics Program; Frederick, Maryland USA

https://doi.org/10.4161/cc.4.11.2124